免疫组化注意事项?
来源：学生作业帮助网 编辑：六六作业网 时间：2024/12/22 18:36:37
免疫组化注意事项?
免疫组化注意事项?
免疫组化注意事项?
1、 标本的固定
组织标本及时的取材和固定是做好免疫组化染色的关键第一步,是有效防止组织自溶坏死,抗原丢失的开始.离体组织应尽快的进行取材固定,最好20分钟内,因为有些抗原若固定不及时可能就检测不到了.而对于固定液的选择,原则上讲,应根据抗原的耐受性来选择相应的固定液,但在病理常规工作中很难做到这一点,因为病理的诊断和鉴别诊断都是在常规HE病理诊断的基础上决定是否进行免疫组化的染色,而HE染色的常规组织处理是采用10%的中性缓冲福尔马林或4%缓冲多聚甲醛进行组织固定,利用其渗透性强,对组织的作用均匀进行固定.组织固定时间最好在6-24小时内,一般组织固定时间不应超过24小时,随着固定时间的延长对组织抗原的检出强度将逐渐降低.另外,非中性福尔马林缓冲液、含酸和含汞固定液亦可导致标记失败或减弱.
2、 蜡块的选择
正确选择用于免疫组化的蜡块也是确保染色质量的关键因素之一.很多病例的组织蜡块不止一个,不同的蜡块中,组织成分常常并不完全一样,一般选择最具代表肿瘤特异性的蜡块,最好含有内对照.更值得注意的是,所选取的蜡块除了要包含代表肿瘤特异性的组织外,应尽量避免含有出血、坏死和脂肪组织.这些组织内的抗原大多已被破坏或丢失,最终通常呈片状弥漫染色,除影响制片的美观外,容易导致误判或误诊.而且这些组织通常影响切片的质量.另外,最好不要选择冰冻剩余组织或脱钙组织,冰冻或脱钙一般也会影响组织内的抗原.
3、 修复方法的选择和对比
抗原修复是指石蜡切片免疫组化染色前用酶、表面活性剂或微波、金属盐等对被掩盖的抗原决定簇或变性的抗原进行暴露和修复,使抗原性得到一定程度的恢复过程.修复的方法有酶（胰酶、蛋白酶等）消化、加热法（水浴、微波和高压煮沸等）和超声处理等,或者综合利用以上方法.目前最常用的是加热煮沸法,少数用酶消化法.大量实验表明,固定时间越长的标本,所形成的交联就越紧密,抗原就越难以被激活,所需的修复强度也就越强.各种修复方法染色强度的比较为：高压法>水浴法>微波法.在日常工作中,要根据不同抗原的特性选择合适的修复方法.抗原修复液常用的有枸橼酸缓冲液（pH 6.0）、EDTA缓冲液（pH 8.9.0）等.修复液的PH值对染色结果也会产生相当大的影响.研究发现在高PH值约pH8.9.0时,都有较好的染色结果,所以目前比较推崇的抗原修复液为高PH值的修复液,尤其是对核阳性的抗体.
4、 确定阳性对照
免疫组化染色过程比较复杂、影响因素也很多,故应设置阳性对照和阴性对照.尤其是阳性对照尤为重要.阳性对照包括两种,一种为内对照,这是一种比较理想的对照,对照和测试组织都在同一张切片中,都处于相同的实验条件下,结果更可靠也更具有可比性.另一种称为外对照,有时在测试的切片中不存在已知的抗原,如在胃的标本中怀疑是恶性黑色素瘤,在正常的胃组织中本身不存在相关的抗原,如果病变出现阳性反应结果,尚能提示是恶黑,但是如果出现阴性结果,就无法确定是本身组织中不含黑色素瘤抗原,还是技术问题.因此,应另外设立一个已知的阳性对照.另外,比较简单的方法,是采用阑尾作为阳性对照.阑尾包含的组织种类较多,如有上皮、淋巴组织、平滑肌、间质、神经、血管、间皮等.因此,一张阑尾切片可以检测大多数常用的抗体.