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农药污染土壤微生物修复研究进展赵斌化学农药作为保障农业丰收的重要手段,在农业生产中发挥着非常重要的作用.然而,由于人们长期施用农药缺乏科学性.尤其是剧毒、高残留、难降解农药的大量使用导致环境中的农药的数量远远超过了环境的自净能力,即超过环境的容量,我们面临着不断增加的土壤、地下水和大气农药污染的环境问题[1~3].国家质检总局公布的最新数据显示,目前我国农药年产量已达40万t,居世界第2位（全世界12亿磅,1997年）.我国每年农业防治约需农药25万t,而农药的利用率只有10%~20%,其余则进入了农作物、土壤.2000年太湖流域农田土壤中15种多氯联苯同系物检出率为100%,六六六、DDT超标率为28%和24%,上海市郊区农田中的DDT含量严重超标,南京市菜地土壤中六六六和DDT的检出率为100%.据统计,我国被污染的土壤面积已达到1300万~1600万hm2,经济损失达10亿元之巨.同样,夏威夷耕地土壤中同样也发现禁用了15年的七氯和七氯环氧化物严重超标[4].由此可见,世界各地土壤中的农药污染问题已经到了非常严重的地步.2001年联合国环境规划署（UNEP）通过的《关于持久性有机污染物的斯德哥尔摩公约》列出了12种优先控制持久性有机污染物（POPs）,其中农药占了9种（艾氏剂、六氯代苯、氯丹、灭蚁灵、狄氏剂、毒杀芬、DDT、异狄氏剂、七氯）；另外,20种被列为潜在持久性有机污染物中农药也占据了大部分[5].这些农药等持久性有机污染物质具有典型的憎水亲脂特性,易吸附于土壤颗粒,在环境中长期存在.土壤农药污染直接导致农产品中农药超标产品品质下降.据2000年国家质检总局数据,全国47.5%的蔬菜农药残留超标,因农残超标被退回的出口农产品金额达74亿美元.另一方面,土壤中农药污染严重威胁到人和动物的健康,将通过食物链在? 脂肪中积累,导致免疫系统、荷尔蒙、生殖系统疾病和诱发癌症[6].我国每年因农药残留急性毒性造成80多人的死亡和800多人中毒事件.农药残留导致的间接的生态环境破坏的损失更加无法估量.鉴于农药残留的持久性、农药施用的普遍性和农药污染的严重性,土壤农药污染的修复成为必须解决的重大问题,引起了众多科研工作者的高度关注.农药污染的微生物修复背景早在20世纪50年代,Cornell大学任教的 Martin Alexander与他的学生就针对《寂静的春天》出版后人们对环境中农药污染和残毒问题的关注而展开了农药在土壤中可降解性的研究,为后来生物技术在环境保护中的应用打下了坚实的基础.生物修复（Bioremediation）是指利用微生物或其他生物将存在于土壤、地下水和海洋中的有毒、有害污染物降解为二氧化碳和水或转化为无害物质的系统,与物理化学方法相比,被公认为是一种有效、安全、廉价和无二次污染的方法[7].1991 年 3 月,第一届原位生物修复（in situ bioremediation）国际会议在美国圣地亚哥召开,标志着以生物修复为核心的环境生物技术进入了一个全新的发展时期.2．降解农药的微生物及其研究　环境中农药的生物降解虽然与植物、土壤微型动物、藻类等有一定的关系、但最主要的降解者是细菌和真菌.由于农药分子的特殊性,一些微生物在降解农药污染物时,需要比降解一般污染物更为复杂的过程,有时一种微生物只完成其中的某一个过程,需要多种微生物的共同作用才能完全降解(夏北成,2002) .能降解农药污染物质的微生物种类很多,大量的研究还在积极地开展,己经证实了能降解有机农药的细菌类有：假单胞杆菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、节细菌属(Arthrobacter)、棒状杆菌属(corynobacterium )、黄杆菌属(Flavobacterium )、微球菌属(Micrococcus )、黄单胞杆菌属(Xarrthomonus )、埃希氏杆菌属(Esherichia )、产碱菌属(Alcaligenes)、气杆菌属(Aerobacter)、固氮极毛杆菌属(Azotomonus )等. 农药降解菌的获得主要是从土壤、水体或污泥等污染环境中直接分离筛选或经富集培养获得.农药降解菌的富集培养方法主要有：瓶培养 即液体富集培养法(Batch culture or liquid enrichment culture)、土壤环流法(Soil percolation or soil perfusion)、连续流动培养法(Continuous flow method) (Huston et al,1981；虞云龙,1996).恒化器作为连续培养是一种有效的方法,它以目标农药作为培养中的限制底物,在这种选择压力的作用下可筛选到降解目标农药的微生物菌株或诱发出有降解能力的突变菌株.农药降解菌的富集现象在土壤中也普遍存在.一种土壤长期使用某一农药可使得该农药降解菌逐渐富集,以后再施入该农药时其分解大大加快,从而导致药效有所降低.微生物对农药的作用可分为两大类：一类是微生物直接作用于农药,大多由酶促反应引起,也称为微生物的农药代谢,一般所说的农药的微生物降解多属此类；另一类是微生物的活动改变了物化环境而间接作用于农药.农药的微生物降解研究从最早的有机氯农药DDT 开始已有几十年的历史.世界各国的科研工作者分离筛选了大量的降解性微生物[8],国内的研究工作者也在这方面做了大量工作,南京农业大学分离鉴定了多株高效降解菌株,建立了目前我国农药微生物降解最大的菌株种质资源库. 细菌由于其生化上的多种适用能力以及容易诱发突变等特性从而占了主要的地位,其中假单胞菌属菌株是最活跃的菌株,对多种农药等化合物有分解作用,其模式菌株 P. putida KT2440 全基因组序列测序已经完成.通过基因工程的手段来获得高效降解菌己成为当前的研究热点.其主要途径为筛选带有突变质粒的菌株以及降解基因构建杂种质粒并使其在合适的寄主中表达(虞云龙,1995, 1996)；通过基因工程构建高效和多功能降解菌.突出的例子如Kellogg等通过几种降解质粒的相互作用筛选出一种质粒突变菌株,可以以2, 4, 5-T为唯一碳源生长(Kellogg,1981),而用常规的连续培养法却一直未能分离到可利用2, 4, 5-T为唯一碳源的降解菌株.但是构建农药降解工程菌的研究还面临不少问题,由于担心这类工程菌对环境会有意想不到的影响,因此要想进入实用阶段必须十分谨慎,同时对降解微生物类群及降解质粒的遗传问题还需更深入的研究.3. 农药微生物降解的代谢途径与降解基因　许多顽固性农药的好氧/厌氧生物降解途径已经被阐明,其中芳香环簇类农药的代谢中包含了许多羟基化开环的过程,单加氧酶将一个氧原子加入底物形成羟基或双加氧酶将两个氧原子加入底物形成两个羟基团导致开环作用,这一步骤在农药的矿化反应中起着非常重要的作用.然而,在有些情况下,农药的代谢是从支链的降解开始的.美国 Minnesota 大学的生物降解与生物催化数据库 (Biodegradation and Biocatalyst Database)收集了农药等化合物的 139 条代谢途径、910 个反应、577种酶、328 个微生物条目、247 条生物转化规律、50个有机功能群、76 个萘的 1,2-双加氧酶反应和 109个甲苯双加氧酶反应,其中包含了许多农药的微生物降解代谢途径和酶类,像对硫磷、阿特拉津、2,4-D、BHC、4-硝基酚、四氢呋喃、S-三嗪、DDT、2,4,5-T 等农药的代谢途径和降解机制已经被详细列出[10].在研究了相关代谢途径的基础上,科研工作者在降解性基因方面也作了大量的研究工作,对一些降解性基因进行了定位,克隆了一些降解性相关 基因.并对降解性基因进行高效表达,研究降解酶的酶学特性,构建多功能高效降解菌株,这些研究一直受到了科研工作者们的关注.农药与其他的有机污染物质一样,微生物的降解代谢方式主要有酶促方式和非酶促方式,而酶促方式则是微生物降解的主要形式.微生物通过酶系中的特殊酶对农药分子的特殊毒性基团进行代谢,使其失去毒性.在此过程中,微生物将农药分子当作自身所需的碳源物质,并在代谢过程中获得自身生长所需的能量.因此,酶促方式的代谢就是解毒代谢.这是微生物抵御不良环境,避免受农药杀伤的一种抗性机制,是微生物种群的生态适应的表现.这种分解代谢常常是在农药污染物浓度较高的情况下进行的.酶促反应的另一种情况是在一些广谱酶的作用下进行水解代谢或者共代谢,或者仅以农药分子作为电子的供体或电子受体,这时微生物对农药的降解代谢不是其生长代谢的主要代谢过程,微生物细胞的生长主要从其他代谢过程获得碳源和能量.当环境中农药浓度较低时,这种代谢方式是主要的方式.非酶促反应方式是生物降解的辅助方式,如通过产生辅助因子促进其它反应的进行或者改变pH而促进反应进行,或者是微生物的其他代谢产物作为农药分子降解的电子受体或者电子供体.总之,非酶促反应只是伴随酶促反应发生的过程.) 由于农药的生物降解受到环境条件和降解微生物种类的影响,因而目前还难以顶见每一类农药的生物代谢途径,而只能总结出一些大概的反应过程.比如己知道许多真菌转化某种农药往往先从羟基化开始,但这种羟基化可能发生在芳环的不同位置或在侧链上,而且在各种真菌之间又各不相同(Bollag,1982；Zheng et al,1989).4．农药降解酶农药在土壤中的降解既可以直接在土壤微生物作用下发生各种生物降解反应,但也可以在没有土壤微生物直接参与的情况下进行,因为土壤中含有大量微生物的胞外酶,而且这些胞外酶的种类很多,如水解酶、氧化酶、脱氢酶、转移酶、酉旨酶、淀移酶.实际上土壤所包含的这些酶就使得土壤具有了生物活性,土壤中的许多反应都是在这些酶的参与下进行.降解酶往往比产生这类酶的微生物菌体更能忍受异常环境条件,如对硫磷水解酶可耐受高达10%的盐浓度,1%的溶剂浓度和50℃的温度,而产生这种酶的假单胞菌在这种条件下是不能生长的(Munnecke,? 1979, 1980).在有些条件下,酶的降解效果远胜于微生物本身,特别是对低浓度农药,降解菌只能利用其它碳源而不能有效地利用农药为碳源(Alexander, 1985).利用降解酶净化土壤中的农药污染研究相对较复杂.由于降解酶在土壤中易受到非生物变性、土壤吸附等作用失活,难以保持长时间的降解活性,因此能否实际应用取决于其稳定性.通过生物工程对农药降解酶基因进行克隆与高效表达来获取降解酶是行之有效的办法.农药降解酶基因的克隆与表达可以构建降解谱广、降解彻底的工程菌,为微生物降解农药开辟新途径;也可将降解酶基因转入易于繁殖的宿主中获得高表达,提高酶产率,同时认清农药微生物降解的生化机制.5．农药微生物修复的影响因素　农药本身的物理性质,尤其是内部化学键、浓度、水溶性、分子极性、生物可利用性、化合物的 吸附性、降解代谢的基因池存在与否和环境因子（温度、盐度、pH、氧化还原电位、营养可利用 程度）等是影响农药等顽固性化合物生物降解和修复的主要因素.微生物对环境污染物的修复能否最终实现不仅仅依赖于其降解能力本身,而且依赖于污染物的生物可利用性以及细菌与土著微生物之间的竞争能力等其他因素.化合物存在的界面尤其重要,因为其不仅影响农药的吸附性,而且能影响不同的微生物类群形成和基因的水平转移性.因此, 污染物的生物可利用性成为成功生物修复的重要障碍之一,增加污染物的溶解性和生物可利用性是生 物学方法进行成功修复的必要条件.近几年来, 科研工作者开始研究细菌的趋化性（chemotaxis）和调控污染环境中降解基因的水平转移来增强细菌的生物修复效果.6.农药污染土壤的微生物修复部分研究　充分研究降解性微生物的生物学特性为将微生物应用于污染物的实际修复提供了理论指导.经过多年的努力,微生物修复已在许多农药污染土壤的消除实践中取得了成功. 农药污染土壤的微生物修复研究呈现两个方面的研究重点.一方面,在许多研究中,通过添加营养元素等外在条件刺激土著降解性微生物的作用来达到修复效果.Fulthorpe等[11]从巴基斯坦土壤中分离的微生物都能矿化2,4-D,并发现添加硝酸盐、钾离子和磷酸盐能增加降解率.加拿大的Stauffer Management 公司数年来发展了一些农药污染土壤的生物修复技术[12],他们在特定环境中通过激发降解性土著微生物群落的功能达到修复目的,并且在美国专利局获得了3项专利.另一方面,许多研究证实了通过接种外源降解 性微生物可以达到很好的生物修复效果.Nassser(1994)从污染了氯乙异丙嗪的土壤中分离到混合微生物培养物,接种到土壤中可将0.14mol的氯乙异丙嗪在25天内完全降解,使其矿化速度提高了20倍.Shapir等人报道,在受除草剂阿特拉津污染的土壤中投加Pseudomonas sp. ADP进行生物强化,可使阿特拉津达到90%~100%的降解.Struthers等分离到A.radiobacter J14a,并将其接种到只具有少量野生降解菌的阿特拉津污染土壤中,发现阿特拉津的矿化速度提高了2~5倍；而将其接种到含大量阿特拉津降解菌的土壤中则缩短了降解的延滞时间.1993~1995年,Spadaro在波兰的ODOT进行了土壤中2,4-D的生物修复田间试验,在厌氧环境下加入厌氧消化污泥,经过7个月的处理,土壤中2,4-D从1100 mg/kg降低到18 mg/kg,并在大规模试验中证实了生物修复的可行性.国内的一些单位也进行了大量的生物修复研究.福建农业大学将分离出的有机氯农药(六六六、DDT)降解菌株制成复合菌剂,应用于盆栽试验和田间小区试验,所得到的降解效应类似于纯培养试验对有机氯的降解率达到了50%~60%.裘娟萍等人通过循环富集法筛得多效唑高效降解菌群,能彻底降解多效唑产生CO2,并建立了受多效唑污染土壤的再生修复技术,35天土壤中多效唑的降解效果达86.2%.张卫等从试验土壤中分离到1株高效降解阿维菌素的菌株,土壤接种该优势菌后有助于加快阿维菌素的降解.虞云龙等研究表明根围土壤丰富的微生物对丁草胺的降解具有显著的促进作用.根围土壤中丁草胺的降解是非根围土壤的1.63~2.34倍,接种处理后这种促进作用得到进一步加强,其降解速率是非根围土壤的1.68~2.83倍.7．农药污染土壤的微生物修复的产业化　国外在生物修复的产业化领域已经具有相当的规模.美国生物修复产业的营业额已经达到了几百亿美元,并形成了一些专业性的公司：如美国 BCI公 司 （ Bioremediation Consulting? Inc.）、 WIKAssociates Inc.、美国工程服务生物修复公司（Engine-ering Services and Bio-remediation Company）等.但这些生物修复产业主要是针对石油烃、持久性有机污染物,而关于农药污染的大规模生物修复仍未形成产业.国内正处于起步阶段,然而却取得了快速的发展.南京农业大学在土壤农药残留的微生物修复方面进行了大量的工作,从 1991 年开始对各种农药残留降解菌株进行了生物学特性和工业化发酵生产工艺等各项技术参数研究,形成了农药污染微生物修复成熟的技术体系和产品,进行了累计几千次田间小试试验和数十次中试规模试验,并将技术产品应用于水稻、韭? 菜、小青菜、芦笙、冬枣等农产品和各种性质的农田土壤的农药污染原位修复,其农药降解率在 80% 以上,修复效果显著.8.农药污染土壤的微生物修复的前景与展望在各种消除农药污染的措施中,微生物修复虽然受农药的种类、环境条件等因素的限制,但因其高效、安全、成本低、无二次污染等而最具有发展前景,这方面的研究将持续快速发展,并推动应用的步伐.总之,随着研究的进一步深入,随着对农药微生物修复技术规律的逐渐掌握,农药生物修复将会有非常广阔的发展空间,在农药环境污染的治理中发挥更大的作用.在今后一段时间内,微生物修复技术研究将在以下几个领域进一步展开：（1）白腐真菌的应用研究；（2）环境微生物种资资源和基因资源的收集与保护；（3）高分子有机污染物降解过程中的共代谢机理；（4）代谢工程与生物修复相结合,解决难降解污染物的生物降解问题；（5）研究微生物在生态系统中的组成中相互关系（信息交流）；（6）污染环境中的降解性微生物分子生态研究；（7）增强微生物降解性能的其他属性（如趋化性）研究（8）土壤宏基因文库中降解性功能基因的筛选；（9）通过遗传工程构建高效降解的微生物菌株；（10）生物降解潜力的指标与生物修复水平的评价；（11）污染环境的生物全细胞检测；（12）生物修复与理化方法结合的综合技术的研究；（13）污染物的资源化及生物修复的产业化等.参考文献：单正军, 朱忠林, 华小梅. 我国农药环境污染及管理现状. 环境保护, 1997, 7:40 ~ 43国家环境保护总局. 我国农药污染现状、存在问题及建议. 环境保护, 2001,6:23 ~ 24赵玲, 马永军. 有机氯农药残留对土壤环境的影响. 土壤, 2001, 33(6): 309 ~ 311