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摘要： HAP转录因子(HAP2/HAP3/HAP4/HAP5) 是存在于酿酒酵母中的一种异源多聚蛋白,它能与酵母中许多启动子上游的CCAAT盒（顺式作用元件）专一性结合, 以增强基因的转录.在酵母hap5突变株的细胞中,用酵母单杂交系统从水稻cDNA-GAL4表达文库中筛选出的阳性克隆是编码谷胱甘肽氧还蛋白的cDNA,提示细胞内的氧化还原系统可能作用于HAP蛋白,从而对CCAAT盒的结合活力起调节作用. 对HAP3亚基分子中半胱氨酸残基的突变实验结果支持上述推测.
关键词： CCAAT,HAP复合物, 转录因子,氧化还原系统
DNA-Binding Activity of the Transcription Factor HAP Is Regulated by Cellular Redox
YAO Quan-Hong, XING Yan-Yan, WANG Zong-Yang, ZHANG Jing-Liu and HONG Meng-Min
Shanghai Institute of Plant Physiology, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200032
Abstract：The CCAAT binding factor of brewer's yeast Saccharomyces cerevisiae has been shown previously to be a heteromeric complex containing HAP2, HAP3, HAP4 and HAP5 subunits. This factor can bind specifically to CCAAT-containing upstream sites within the promoters of numerous yeast genes, and then activate the transcription. By using a yeast one-hybrid system, we tried to isolate the counterpart of the yeast HAP5 gene from rice cDNA-Gal4 fusion library constructed in a E.coli-yeast shuttle vector pPC86. However, we identified a cDNA encoding glutaredoxin (Fig．1). The results indicte that the cellular redox environment of yeast cell may be a factor regulating the CCAAT-box-binding activity of the HAP3 subunit (Table 1). The results of the HAP3 mutants in which the highly conserved cysteine residues at positions 68 and 72 had been converted to serine support the above suggestion (Table 2).
Key words: CCAAT, HAP complex, transcription factor, redox system
真核基因转录起始时,有一些被称为转录因子的核蛋白会结合在真核基因启动子上游的顺式作用元件上,以增强或阻遏真核基因的转录(Wolberger 1993). 有些转录因子要经过磷酸化或二聚化,引起蛋白分子的构型发生一些改变后,才具有与DNA结合的能力（Hunter和 Karin 1992）.最近Zheng 等（1998）报告,有些转录因子与DNA 的结合活力受细胞中的氧化还原状态的调节.例如,用凝胶滞后试验在体外研究Jun和Fos转录因子与含Ap-1结合位点的DNA的结合作用时,观察到硫氧还蛋白(thioredoxin)、还原辅酶Ⅱ(NADPH)与硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase)可明显提高它们的异源二聚体与DNA的结合能力(Abate等1990).
在一些真核基因转录起始点上游存在核心序列为CCAAT的顺式元件,该元件可呈正、反两种方向(Van Huijsduijnen等 1987). 已知酿酒酵母中至少有16种基因的5’端上游都含CCAAT元件.与这些基因上游的CCAAT结合以调节基因转录的反式作用因子是HAP复合物(Pinkham和Keng 1992), 它是由HAP2、HAP3、HAP4和HAP5 四个蛋白亚基组成的异源多聚体,其中HAP2和HAP3都含有DNA结合域,但单独的HAP2和HAP3蛋白都不具DNA结合活性,只有当HAP2与HAP3 通过它们的亚基结合域形成二聚体蛋白时才构成一个完整的CCAAT盒结合功能域(Xing 等1993) .而且体内与体外的研究都证实,这种复合功能域的形成还需要HAP5亚基的参与（McNabb等1995）.HAP4亚基含有活化结构域(activation domain),起活化基因转录的作用(Foraburg和Guarente 1989).近年来,已从粟酒裂殖酵母、小鼠、大鼠、人等生物中克隆了编码CCAAT盒结合蛋白的基因, 这些CCAAT结合蛋白与酵母HAP转录因子类似蛋白间存在高度同源的结构域(Van Huijsduijnen等1990)；在高等植物中, 也已从油菜中克隆了与HAP2亚基中DNA结构域高度同源的基因(Albani和Robert 1995).
我们曾报告,用酿酒酵母CYC1基因启动子上游含CCAAT盒的DNA片段为“鱼铒”,在HAP2基因突变的酵母细胞中,用酵母单杂交方法从水稻cDNA-GAL4 表达文库中筛选出了编码HAP2类似蛋白的cDNA克隆(姚泉洪等待发表).本研究用相似的方法,在HAP5突变的酵母细胞中,用酵母单杂交方法, 试图从水稻cDNA-GAL4 表达文库中筛选出编码水稻HAP5类似蛋白的cDNA.但HAP5类似cDNA没有筛到,却几次筛选到水稻中编码谷胱甘肽氧还蛋白(glutaredoxin)的cDNA.这一意外的结果提示我们HAP转录因子与DNA结合受氧化还原（redox）调节的可能性. 本文报告上述实验结果以及对HAP3亚基中半胱氨酸残基进行的突变实验,并就HAP转录因子的DNA结合活力是否受氧化还原调节的问题进行了讨论.
1 材料与方法
1.1 工具酶与化学试剂 限制性内切酶和其它基因工程工具酶为德国Boeringer公司产品,X-gal购自Sigma公司,其它化学试剂为美国Sigma公司或国产AR级试剂.
1.2 菌种和质粒 MC8为氨基酸缺陷型大肠杆菌菌株(thi－,trp－,ura－,leu－,his－).酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）hap5缺陷型菌株为Δhap5-10 (MATα,leu 2-3,112,ura3-52,his4-519,adel-100,trp1 Δhap5).大肠杆菌-酵母穿梭载体pLG Δ-265 UP1带有lacZ报告基因、URA选择标记、2μ复制序列和酵母CCAAT盒.lacZ报告基因由CYC1的基本启动子控制,而含CCAAT盒的DNA片段位于CYC1的基本启动子上游,此元件被转录因子结合后,即可调节lacZ基因的表达.酿酒酵母-大肠杆菌穿梭载体pPC86带有色氨酸合成酶基因,系朱群博士赠送.pDB20(HAP5)质粒带LEU选择标记,该载体由ADH1启动子控制酵母HAP5基因的表达用作鉴定水稻类似HAP5 cDNA时的阳性对照.pYP2质粒由本实验室构建,它带有PGK启动子及色氨酸合成酶基因,PGK启动子后的BamHⅠ和KpnⅠ切点间插入用于表达的cDNA.
1.3 PCR引物 酵母pPC86载体cDNA插入5'端Gal4激活功能域侧的引物为：GAL4(5'-GGATGTTTAATACCACT-3'）,3'端ADH终止子侧的引物为：TAD4(5'-TTGATTGGAGACTTGACC-3').水稻谷胱甘肽氧还蛋白cDNA(Minakichi等1994)两侧的引物分别为：5'端翻译启始密码子ATG附近的引物Gluta1(5'AAGGATCCATGGCGCTCGCCAAGGCCAAG 3'), 3'端翻译终止密码子TAG附近的引物Gluta2(5'TTGTGGTACCTATGCGGTGATTGTCGTCTTTG 3').酿酒酵母HAP3基因(Hahn等1988)两侧的引物分别为：5'端翻译起始密码子ATG附近的引物HAP3Z1(5'AAGGATCCATGAATACCAACGAGTCC 3'),3'端翻译终止密码子TGA附近的引物HAP3F1(5'TTGTGGTACCTCAAGGCACCTCTTCG 3').用于酿酒酵母HAP3基因第68位Cys突变为Ser的内侧突变引物分别为：含突变碱基的5'端引物HAP3Z2(5' CGAAAGAGTCCATGCAGGAG 3'),含突变碱基的3'端引物HAP3F2(5'CTCCTGCATGGACTCTTTCG 3').用于酿酒酵母HAP3基因第72位Cys突变为Ser的内侧突变引物分别为：含突变碱基的5'端引物HAP3Z3( 5'CATGCAGGAGTCTGTCAGTG 3') ,含突变碱基的3'端引物HAP3F3(5'CACTGACAGACTCCTGCATG 3').
1.4 酵母表达型水稻cDNA库 构于酵母载体pPC86的水稻IR36幼苗的表达型cDNA库由美国Salk研究所的朱群博士提供.
1.5 培养基 大肠杆菌MC8生长于添加亮氨酸、尿嘧啶、组氨酸、维生素B1的M9基本培养基, 用于选择带有水稻cDNA的pPC86质粒.含2％葡萄糖或2％乳酸的酿酒酵母丰富培养基YPD、基本培养基SC及酵母X-gal培养基的制备参照Sherman（1991）的方法.
1.6 酵母感受态细胞的制备及质粒转化 酿酒酵母的质粒转化选用Gietz等(1992)的醋酸锂法.于30℃过夜培养5 ml酿酒酵母至OD600为0.5左右,扩大培养至50ml,再生长4h后,5000×g离心8min收集细胞.以20ml无菌水洗,然而把离心收集的酵母以10ml新配的LiAc溶液100mmol/L(用pH 8.0的Tris 10mmol/L、 EDTA 0.1mmol/L 缓冲液配制)洗1次.7000×g离心8min后,最终将酵母细胞悬于0.5ml的LiAc溶液中.50μl的酵母悬液中加入 1μg的质粒DNA、50μg的鲑鱼精DNA及300μl含40% PEG3350的LiAc溶液,充分混匀后于30℃保温30min.接着于42℃热激15min.把离心收集的酵母细胞重悬于TE溶液中,并涂于酵母选择培养基.
1.7 DNA操作 酵母DNA的快速抽提按Robzyk和Kassir（1992）的方法.DNA操作按标准的分子克隆步骤（Sambrook等1989）.大肠杆菌的电击转化按Dower等(1988)的方法.抽提含水稻cDNA阳性质粒的双链DNA,在ABI 377型DNA自动化测序仪上进行序列测定. 引物GAL4与TAD4间的PCR扩增反应条件为：94℃ 40s, 42℃ 50s, 72℃ 3min,共扩增30个循环.水稻谷胱甘肽氧还蛋白cDNA两侧引物Gluta1和Gluta2间的PCR扩增反应条件为：94℃ 30s, 66℃ 45s, 72℃ 30s,共扩增30个循环.酵母HAP3基因的定点突变采用重叠延伸法(Ho等1989).HAP3外侧引物间及外侧引物与内侧引物突变间的PCR扩增反应条件为：94℃ 30s, 48℃ 40s,72℃ 30s,共扩增30个循环.
2 结果
2.1 酵母单杂交法筛选水稻中类似酵母HAP5基因的cDNA
酵母单杂交体系最初是由Wang和Reed (1993)所设计,它含两个质粒：其一为酵母表达质粒,用于表达cDNA与GAL4激活功能域的融合蛋白;另一质粒将一个顺式作用元件与带有基本启动子的细菌lacZ报告基因连接,该载体称作鱼饵质粒.本实验酵母单杂交体系中所用的鱼饵质粒为pLGΔ-265 UP1,该载体是把含CCAAT的顺式作用元件插入到178载体中CYC1基本启动子上游构建而成.我们先将鱼饵质粒pLGΔ-265 UP1转化入酵母菌株Δhap5-10,在不含尿嘧啶的平皿上得到转化子Δhap5-10(pLGΔ-265 UP1).然后将30μg含水稻cDNA的pPC86载体转化到感受态酵母中,于不含尿嘧啶和色氨酸的培养基上培养.得到3×106左右的转化子,用硝酸纤维膜将这些转化子复印至X-gal平板上进行显色反应.作为阳性对照,含HAP5基因表达载体pDB20(HAP5）及鱼饵质粒pLGΔ-265 UP1的Δhap5-10酵母菌株经培养6 h后已显蓝色.而含水稻cDNA库的质粒pPC86的Δhap5-10(pLGΔ-265 UP1)酵母菌株2 d后才出现蓝色菌落.此实验重复进行了4次,一共获45个蓝色酵母菌落.
2.2 酵母阳性菌落的重复筛选
为了验证初筛得到的酵母阳性菌落中是否含有相似于HAP5功能的cDNA克隆,从上述45个酵母阳性菌落中抽提DNA,用电击法将DNA转化到大肠杆菌MC8中,培养于2YT+Ap平板,然后复印至不含色氨酸的M9培养基平板上培养.因为pPC86质粒上带有编码TRP合成酶的标记基因,因此能生长出的菌落表明它带有pPC86质粒.然后再从能在不含色氨酸M9培养基上生长的大肠杆菌中抽提质粒DNA,将这些质粒DNA分别转化到酵母Δhap5-10(pLGΔ-265 UP1)菌株中,于X-gal平板上进行显色,从中鉴定出能使酵母菌落重复变蓝的cDNA克隆17个.
2.3 阳性克隆的鉴定和测序
由于hap5缺陷型酵母不能在含非发酵性碳源的培养基上生长,我们将4次酵母单杂交筛选并经复筛后留下的17个阳性质粒转化入Δhap5-10缺陷型酵母进行功能互补法鉴定.结果表明,这些含水稻cDNA的阳性质粒都不能使hap5缺陷型酵母在非发酵性碳源的培养基上生长.它们都没有补偿缺陷型酵母中所缺失的HAP5的功能,因此不是编码类似HAP5的cDNA克隆.为了弄清它们的结构,我们以GAL4和TAD4为引物进行PCR扩增.并对扩增出的cDNA顺序分别进行Sau3AⅠ酶切,根据酶切带型对各批筛出的cDNA进行归类.结果表明,17个中有6个筛出的阳性cDNA具类似酶切带型；4次筛库中有3次获得该类cDNA克隆.我们以GAL4和TAD4两引物直接对具相似酶切带型、编号为C3的cDNA进行DNA序列分析,图1的结果显示其核苷酸与已报道的水稻谷胱甘肽氧还蛋白cDNA序列完全相同(Minakichi等1994).我们又按照所测出的水稻谷胱甘肽氧还蛋白cDNA的核苷酸顺序,合成了cDNA两端的寡核苷酸引物gluta1和gluta2,并对所获的6个具相同酶切带型的cDNA克隆进行PCR扩增,结果也确证它们都是编码水稻谷胱甘肽氧还蛋白的cDNA.

图1 水稻C3 cDNA克隆的核苷酸顺序及推导的氨基酸序列
Fig.1 Sequence of the C3 cDNA clone and predicted amino acid sequence
2.4 C3所编码的谷胱甘肽氧还酶对HAP复合物DNA结合活性的影响
以C3的DNA为模板,用两端分别存在BamHⅠ和KpnⅠ酶切点的gluta1和gluta2为引物进行PCR扩增.将此含glutaredoxin基因完整编码区的PCR扩增片段经BamHⅠ和KpnⅠ酶切后克隆到酵母表达载体pYP2中PGK启动子后的相应酶切点间,构成酵母重组质粒pYP3.接着将pYP2、pDB20、pDB20(HAP5)与pYP3等4种质粒分别转化到已经带有质粒p178或pLGΔ-265 UP1的两酵母菌株Δhap5-10(p178)和Δhap5-10(pLGΔ-265 UP1)中.将上述4种质粒分别转化两株酵母菌株.这两株酵母菌株为hap5突变株,但含有具激活功能的HAP4蛋白,有结合功能的HAP2、HAP3蛋白.在不含尿嘧啶和色氨酸的培养基上得到转化子,并将这8种酵母转化子用硝酸纤维素膜分别复印至X-gal平板上进行显色反应,2 d后转化子Δhap5-10( pYP3+pLGΔ-265 UP1)显蓝色,阳性对照菌株Δhap5-10(pDB20(HAP5)+pLGΔ-265 UP1)菌落呈深蓝色,而阴性对照菌株Δhap5-10(pYP2+pLGΔ-265UP1)和Δhap5-10(pDB20+pLGΔ-265 UP1)以及4种质粒在酵母菌株Δhap5-10(178)中的转化子都没有蓝色显现(表1).说明glutaredoxin能使HAP2、HAP3与HAP4在没有HAP5的情况下使lacZ基因得到表达.
表1 C3所编码的glutaredoxin对鱼饵质粒上lacZ基因表达的影响
Table 1 Effects of glutaredoxin encoded by C3 on the lacZ gene expression in bait plasmid

Plasmid Expression of lacZ gene
p178 pLGΔ-265 UP1
pYP2 － －
pDB20 － －
pDB20(HAP5) － +++
pYP3 － +
2.5 HAP3蛋白Cys位点突变对HAP复合物DNA结合活性的影响
在hap5缺失型酵母细胞中,glutaredoxin能使HAP2、HAP3与HAP4一起使lacZ表达.由于已知glutaredoxin是参与调节细胞氧化还原状态（redox）的主要成分,因此我们推测它对HAP蛋白的作用可能是调节HAP蛋白中－SH与－S－S的可逆反应.为弄清它是否起这种作用,我们将HAP3基因第68位及第72位Cys突变为Ser,来验证此种推测是否正确.方法是以Δhap5-10菌株DNA为模板,分别以HAP3Z1、HAP3F2及HAP3Z2、HAP3F1这两对引物进行PCR扩增.再以回收的两个PCR产物为模板,通过HAP3Z1和HAP3F1引物扩增出第68位Cys突变为Ser的HAP3基因.并以同样的方法获得第72位Cys突变为Ser的HAP3基因.分别将HAP3基因及两突变基因的BamHⅠ和KpnⅠ酶切产物克隆入pYP2酵母表达载体,构成带有HAP3基因的质粒pYP4、带有第68位Cys突变为Ser的HAP3基因的质粒pYP5及第72位Cys突变为Ser的HAP3基因的质粒pYP6.接着把pYP4、pYP5和pYP6质粒分别转化入含质粒p178和pLGΔ-265 UP1的酵母Δhap5-10菌株中,在不含尿嘧啶和色氨酸的培养基上选择酵母转化子.转化子用硝酸纤维膜复印至X-gal平板上进行显色反应,2 d后两种带有HAP3发生突变基因的质粒的转化子在没有glutaredoxin存在的情况下都显示出蓝色.而带有正常HAP3基因质粒的转化子没有显示蓝色,且转化到Δhap5-10(178)菌株中的4种转化子也没有显示蓝色(表2).该结果说明在hap5基因突变酵母细胞中,－SH被突变后的HAP3亚基与细胞中的HAP2、HAP4,即能在单杂交系统中使lacZ基因组成性地表达,而无需glutaredoxin的氧还调节.
表2 HAP3蛋白Cys位点突变对鱼饵质粒上lacZ基因表达的影响
Table 2 Effects of mutant HAP3 at cysteine residues on the lacZ gene expression in bait plasmid

Plasmid Expression of lacZ gene
p178 pLGΔ-265 UP1

pYP2 － －
pYP4 － －
pYP5 － +
pYP6 － +
3 讨论
细胞中存在多个调节细胞氧化还原(redox)状态的系统,其中之一为谷胱甘肽氧还蛋白系统,此系统包含谷胱甘肽、谷胱甘肽还原酶与谷胱甘肽氧还蛋白(Holmgren 1989).该系统通过谷胱甘肽氧还蛋白中半胱氨酸残基上的－SH氧化成－S－S－键或可逆地还原成－SH来调节细胞中的redox状态.这种redox状态也促使某些功能性蛋白分子上的－SH或－S－S－随即发生可逆的氧化或还原,并引起蛋白分子的构型改变,从而影响蛋白分子的活性、稳定性与正确的折叠等重要功能(Holmgren 1989).
我们在HAP2酵母突变株细胞中,用酵母单杂交方法从水稻cDNA-GAL4 表达文库中成功地筛选到水稻中与HAP2类似的基因RAPB,且RAPB基因可互补酵母的hap2缺陷.这表明用此套单杂交系统来筛选转录因子基因是有效的.按推理,用相同的酵母单杂交系统,在酵母hap5突变株细胞中也应能筛选到水稻的HAP5类似基因,但是所得到的阳性cDNA克隆都不能互补酵母HAP5的缺陷性状.对所得到的阳性cDNA克隆进行核苷酸顺序分析的结果表明,从水稻cDNA文库中得到的这些cDNA所编码的是谷胱甘肽氧还蛋白,而不是期望的水稻编码类似酵母HAP5蛋白.Minakichi等(1994)曾报告水稻glutaredoxin基因的表达主要集中于种子中,而在叶片中的表达很低.而4次筛水稻叶片表达型库过程中有3次筛到glutaredoxin基因,这说明这一实验结果并非偶然.至于为何未筛到HAP5类似基因,是由于我们所用的水稻cDNA-GAL4表达文库中没有HAP5-cDNA,还是由于水稻中没有类似此功能的基因,这还有待进一步研究.
酵母功能互补试验显示水稻glutaredoxin基因没有明显的互补HAP5基因的活性；酵母单杂交试验的结果也说明水稻glutaredoxin基因增强lacZ基因表达的活性远低于HAP5基因.有人推测酵母HAP5蛋白的功能可能是与HAP2和HAP3两亚基间发生疏水相互作用,从而促使形成一种稳定的能结合CCAAT盒的复合结构(McNabb等1995).如果这种推测是正确的话,那么glutaredoxin的作用也可能是使HAP3亚基保持－SH基状态,从而使HAP2和HAP3之间形成一种不稳定的与CCAAT盒结合较弱的复合结构.glutaredoxin对HAP复合物DNA结合活性的促进及HAP3亚基中半胱氨酸残基突变成丝氨酸残基实验的结果与上述推测较相符.即第68和72位Cys突变为Ser的HAP3蛋白和HAP2蛋白相互作用即具有CCAAT盒结合活性.
到目前为止,已经报告过许多转录因子,如c-fos和c-jun(Abate等1990),NFκB/Rel(Matthews等 1992),c-Myb(Guehmann等1992),BPV-1(McBride等1992),USF(Pognonec等1992)和NF-Y(Nakshatri等1996)等的DNA 结合活力均受redox调节.其中NF-Y是从人与小鼠细胞中克隆出的能与CCAAT盒结合的转录因子, 它也是异源多聚体蛋白.NF-YA、NF-YB分别为酿酒酵母的HAP2、HAP3的类似基因,两者中有高度同源的结构域,且功能上可互换(Maity等1992, Kim等1996,Coustry等1995).另外至今所发表的HAP3类似蛋白中3个半胱氨酸残基的位置是保守的(Xing等1993).
Nakshatri等(1996)报告小鼠的NF-Y转录因子与CCAAT盒在体外的结合活力受redox 状态的调节.硫氧还蛋白可以增强NF-Y异源多聚蛋白与CCAAT盒结合的活力,当－SH基被烷化后NF-Y与CCAAT的结合活性受到破坏.通过将蛋白分子的半胱氨酸残基逐个突变去除,证明受调节的是NF-YB亚基中的第85位与89位上的两个半胱氨酸,已知硫氧还蛋白与谷胱甘肽氧还蛋白一样,也是细胞中一种氧化还原调节系统, 因此我们报告的glutaredoxin在没有HAP5的情况下能使HAP2 与HAP3 结合在CCAAT盒上的发现,与他们的结果特别是硫氧还蛋白对NF-Y蛋白与CCAAT盒结合活性的调节作用可以互为佐证,并对进一步了解HAP5(NF-YC)亚基的功能有重要的意义.
国家自然科学基金(39893320)资助项目.
作者单位：中国科学院上海植物生理研究所,上海 200032