原位杂交的主要程序?
来源：学生作业帮助网 编辑：六六作业网 时间：2024/11/22 23:48:23
原位杂交的主要程序?
原位杂交的主要程序?
原位杂交的主要程序?
1、使用地高辛标记的核酸探针进行石蜡切片的RNA原位杂交第一天
1） 二甲苯于37℃脱蜡2次,每次15分钟；
2） 无水乙醇浸泡2次,每次3分钟；
3） 95%乙醇浸泡2次,每次3分钟；
4） PBS清洗3分钟；
5） 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；
6） PBS清洗10分钟；
7） 加入胃蛋白酶25ul/ml,37℃孵育15分钟；
8） PBS清洗2次,每次3分钟；
9） 0.2N的HCl孵育30分钟；
10）PBS清洗2次,每次3分钟；
11）0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；
12）PBS清洗2次,每次5分钟；
13）预杂交缓冲液孵育30分钟；
14）准备核酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针,85℃加热5分钟,置于冰块中10分钟；
15）杂交；第二天
16）将玻片置于SSC中2次,每次5分钟以去除封片；
17）PBS清洗3分钟；
18）RNA酶A溶液中（或0.1-1ng/mlPBS中）,37℃孵育30分钟；
19）PBS清洗5分钟；
20）室温,2×SSC清洗10分钟；
21）37℃,1×SSC清洗10分钟；
22）37℃,0.5×SSC清洗10分钟；
23）缓冲液A孵育10分钟；
24）缓冲液A（1%正常绵羊血清和0.03%三重氢核X-100）孵育30分钟；
25）加入抗地高辛抗体（1/200的上述缓冲液,来自Boehringer Mannheim）,37℃孵育3 小时；
26）缓冲液A清洗2次,每次10分钟；
27）缓冲液B清洗2次,每次5分钟；
28）制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟,显微镜下进行观察,如果背景尚佳,显色时间可延长到16小时；
29）停止缓冲液B的反应,用水进行简单的清洗；
30）固红,脱水以及封片进行核的复染.
2、使用地高辛标记的寡核苷酸探针进行石蜡切片的原位DNA杂交第一天
1） 二甲苯于37℃脱蜡2次,每次15分钟；
2） 无水乙醇浸泡2次,每次5分钟；
3） 95%乙醇浸泡2次,每次5分钟；
4） PBS清洗5分钟；
5） 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；
6） PBS清洗5分钟；
7） 加入胃蛋白酶25ul/ml,37℃孵育10分钟；
8） PBS清洗2次,每次5分钟；
9） 0.2N的HCl孵育30分钟；
10）PBS清洗2次,每次5分钟；
11）0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；
12）PBS清洗5分钟；
13）预杂交缓冲液孵育30分钟；
14）准备寡核苷酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针；
15）杂交；第二天
16）将玻片置于SSC中以去除封片；
17）室温,2×SSC清洗10分钟；
18）37℃,1×SSC清洗10分钟；
19）37℃,0.5×SSC清洗10分钟；
20）缓冲液A孵育10分钟；
21）缓冲液A孵育30分钟；
22）加入抗地高辛抗体37℃孵育3小时；
23）缓冲液A清洗2次,每次5分钟；
24）缓冲液B清洗2次,每次5分钟；
25）制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟,显微镜下进行观察,如果背景尚佳,显色时间可长到16小时；
26）停止缓冲液B的反应,用水进行简单的清洗；
27）固红,脱水以及封片进行核的复染.
不同作物，不同物种方法和步骤不尽相同。
http://baike.baidu.com/view/119339.htm?fr=ala0_1_1看看吧 很全的