原位杂交的主要程序?
来源:学生作业帮助网 编辑:六六作业网 时间:2024/12/24 10:19:00
原位杂交的主要程序?
原位杂交的主要程序?
原位杂交的主要程序?
1、使用地高辛标记的核酸探针进行石蜡切片的RNA原位杂交第一天
1) 二甲苯于37℃脱蜡2次,每次15分钟;
2) 无水乙醇浸泡2次,每次3分钟;
3) 95%乙醇浸泡2次,每次3分钟;
4) PBS清洗3分钟;
5) 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟;
6) PBS清洗10分钟;
7) 加入胃蛋白酶25ul/ml,37℃孵育15分钟;
8) PBS清洗2次,每次3分钟;
9) 0.2N的HCl孵育30分钟;
10)PBS清洗2次,每次3分钟;
11)0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟;
12)PBS清洗2次,每次5分钟;
13)预杂交缓冲液孵育30分钟;
14)准备核酸探针混合物:使用预杂交缓冲液稀释探针,85℃加热5分钟,置于冰块中10分钟;
15)杂交;第二天
16)将玻片置于SSC中2次,每次5分钟以去除封片;
17)PBS清洗3分钟;
18)RNA酶A溶液中(或0.1-1ng/mlPBS中),37℃孵育30分钟;
19)PBS清洗5分钟;
20)室温,2×SSC清洗10分钟;
21)37℃,1×SSC清洗10分钟;
22)37℃,0.5×SSC清洗10分钟;
23)缓冲液A孵育10分钟;
24)缓冲液A(1%正常绵羊血清和0.03%三重氢核X-100)孵育30分钟;
25)加入抗地高辛抗体(1/200的上述缓冲液,来自Boehringer Mannheim),37℃孵育3 小时;
26)缓冲液A清洗2次,每次10分钟;
27)缓冲液B清洗2次,每次5分钟;
28)制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟,显微镜下进行观察,如果背景尚佳,显色时间可延长到16小时;
29)停止缓冲液B的反应,用水进行简单的清洗;
30)固红,脱水以及封片进行核的复染.
2、使用地高辛标记的寡核苷酸探针进行石蜡切片的原位DNA杂交第一天
1) 二甲苯于37℃脱蜡2次,每次15分钟;
2) 无水乙醇浸泡2次,每次5分钟;
3) 95%乙醇浸泡2次,每次5分钟;
4) PBS清洗5分钟;
5) 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟;
6) PBS清洗5分钟;
7) 加入胃蛋白酶25ul/ml,37℃孵育10分钟;
8) PBS清洗2次,每次5分钟;
9) 0.2N的HCl孵育30分钟;
10)PBS清洗2次,每次5分钟;
11)0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟;
12)PBS清洗5分钟;
13)预杂交缓冲液孵育30分钟;
14)准备寡核苷酸探针混合物:使用预杂交缓冲液稀释探针;
15)杂交;第二天
16)将玻片置于SSC中以去除封片;
17)室温,2×SSC清洗10分钟;
18)37℃,1×SSC清洗10分钟;
19)37℃,0.5×SSC清洗10分钟;
20)缓冲液A孵育10分钟;
21)缓冲液A孵育30分钟;
22)加入抗地高辛抗体37℃孵育3小时;
23)缓冲液A清洗2次,每次5分钟;
24)缓冲液B清洗2次,每次5分钟;
25)制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟,显微镜下进行观察,如果背景尚佳,显色时间可长到16小时;
26)停止缓冲液B的反应,用水进行简单的清洗;
27)固红,脱水以及封片进行核的复染.
不同作物,不同物种方法和步骤不尽相同。
http://baike.baidu.com/view/119339.htm?fr=ala0_1_1看看吧 很全的