地高辛标记cRNA探针显色的基本步骤是什么?
来源:学生作业帮助网 编辑:六六作业网 时间:2024/12/24 20:29:04
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地高辛标记cRNA探针显色的基本步骤是什么?
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地高辛标记cRNA探针显色的基本步骤是什么?
显色:
(1)用缓冲液1冲洗杂交后的载片2×3min.
(2)在缓冲液1中10min,室温以封闭非特异性结合部位.
(3)拭干切片周围的载片,注意保持切片湿润.加数滴抗地高辛抗血清(工作浓度1:500,以缓冲液1稀释),孵育2h,室温.
(4)缓冲液1漂洗3×3min.
(5)浸入缓冲液210min室温.
(6)浸入底物中孵育10~30min(或更长时间,视需要而定),底物内含显色BCIP/NBT,室温.最好用锡箔纸包裹反应盒,使显色在黑暗中进行.定期取出切片在显微镜下检测反应强度.根据反应强度决定延长或终止反应.反应颜色为紫蓝色.
(7)将切片浸入缓冲液3以终止反应.
(8)复染,可用1%伊红、1%苏木精、1%亮绿或5%的焦宁(又称派咯宁丫)(pyronin 丫)10~30s.
(9)流水洗5~10min,直至水无色为止.
(10)在切片未干前,以PBS/甘油封固切片,如要永久保存,可以用DPX在盖片四周封固.为去除水份,在封固前可进行梯度酒精脱水,透明,DPX封固,但每步时间仅需几秒钟,时间过长易致褪色.
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