我想问一下关于nuclear run-on assay的原理以及其与Northern blot的比较,核连缀实验，
来源：学生作业帮助网 编辑：六六作业网 时间：2024/12/20 05:54:21
我想问一下关于nuclear run-on assay的原理以及其与Northern blot的比较,核连缀实验，
我想问一下关于nuclear run-on assay的原理以及其与Northern blot的比较,
核连缀实验，
我想问一下关于nuclear run-on assay的原理以及其与Northern blot的比较,核连缀实验，
Northern印迹杂交（Northern blot）.
原理：
将RNA固定于尼龙膜上
以DNA探针识别待检mRNA
这是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法.DNA印迹技术由Southern于1975年创建,称为Southern印迹技术,RNA印迹技术正好与DNA相对应,故被称为Northern印迹杂交,与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为Western blot.Northern 印迹杂交的RNA吸印与Southern印迹杂交的DNA吸印方法类似,只是在进样前用甲基氢氧化银、乙二醛或甲醛使RNA变性,而不用NaOH,因为它会水解RNA的2'-羟基基团.RNA变性后有利于在转印过程中与硝酸纤维素膜结合,它同样可在高盐中进行转印,但在烘烤前与膜结合得并不牢固,所以在转印后用低盐缓冲液洗脱,否则RNA会被洗脱.在胶中不能加EB,因为它会影响RNA与硝酸纤维素膜的结合.为测定片段大小,可在同一块胶上加分子量标记物一同电泳,之后将标记物切下、上色、照像,样品胶则进行Northern转印.标记物胶上色的方法是在暗室中将其浸在含5μg/ml
EB的0.1mol/L醋酸铵中10min,光在水中就可脱色,在紫外光下用一次成像相机拍照时,上色的RNA胶要尽可能少接触紫外光,若接触太多或在白炽灯下暴露过久,会使RNA信号降低.琼脂糖凝胶中分离功能完整的mRNA时,甲基氢氧化银是一种强力、可逆变性剂,但是有毒,因而许多人喜用甲醛作为变性剂.所有操作均应避免RNase的污染.
Nuclei Run-on
原理：
迅速冷冻,使细胞核内正在转录的mRNA复合体处于冻结状态
加入ATP/GTP/CTP/32P-UTP,重新恢复mRNA的转录并使之结束（标记冻结时正在转录的mRNA),提取mRNA
以cDNA探针及对照cDNA标记尼龙膜后检测目标mRNA
2、操作过程：
细胞核的提取
处理细胞（培养于10厘米培养皿）
吸去培养液,迅速将细胞放于冰上
用10ml冰预冷的PBS洗细胞一次
加10ml冰预冷的PBS,刮下细胞,移入离心管
500g离心5分钟后弃去液体
边混悬边加入4ml NP－40裂解液
10mM Tris-HCL,PH7.4
10mM NaCL
3mM MgCL2
0.5% NP-40
置冰上孵育5分钟,同前离心,弃去上清
以4ml NP－40裂解液重悬沉淀、洗涤,同前离心并弃去上清
以200ul甘油储存液重悬沉淀,保存于液氮中甘油
50mM Tris-HCL,PH8.3
40%甘油
5mM MgCL2
0.1mM EDTA
Run-on
将冻存的细胞核解冻
加入200ul 2X反应缓冲液
10mM Tris-HCL,PH8
5mM MgCL2
0.3M KCL
5mM DTT
1mM ATP
1mM CTP
1mM GTP
加入32P-UTP100uCi
于30℃反应30分钟,同时震荡
总RNA提取：
加入1.4ml RLT（QIAGEN公司）
用Rneasy Mini Kit抽取总RNA
用700ul SW1洗一次
用500ul RPE洗4次
用110ul RNase free ddH2O洗脱两次
取3ul加入液闪检测液测取CPM值
探针cDNA标记尼龙膜：
0.5N NaOH处理尼龙膜
5－10ug/样点膜
自然晾干
Crosslink
4) 杂交：
取相等CPM量RNA,加入2ml TES/0.6M NaCL
10mM TES
10mM EDTA
0.2%SDS
在杂交炉中,68℃反应过夜
用2XSSC/0.1%SDS洗膜三次
用0.1XSSC/0.1%SDS洗膜三次
曝光于X光胶片
what are they?