如何对某种生物进行全面的基因组学研究?能不能给一个大体的流程计划啊?

如何对某种生物进行全面的基因组学研究?能不能给一个大体的流程计划啊?
如何对某种生物进行全面的基因组学研究?能不能给一个大体的流程计划啊?

如何对某种生物进行全面的基因组学研究?能不能给一个大体的流程计划啊?
对生物进行基因组学研究即对之进行核酸序列分析,方法是人工合成不同长度的成套DNA片段并以放射性元素等方式标记,各个人工合成片段起点碱基相同,终点不同,使DNA链中的每个核苷酸处都有DNA的断裂或终止,通过聚丙烯酰胺电泳,能够将相差一个核苷酸的DNA片段分开,用适当的检测手段读出核苷酸序列,再通过计算机分析得到一个完整的DNA序列.
这样得到的DNA序列建立起基因数据库,由于生物具有同源性,在之后的生物的测序中可以利用已得的数据,减少工作量,并可以比较生物之间的亲缘关系.
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-----以上手工录入,以下来自网络-----
核酸序列的一般分析流程：
http://www.bioguider.com/Article_Print.asp?ArticleID=1851
核酸是生命的遗传物质,遗传信息存在于4种单核苷酸(A,G,C,T／U)按不同顺序连接而成的核酸分子中,迅速准确地解读决定生命性状的密码,测定基因组的核酸序列,对于识别病原,揭示疫病变化规律是任何方法都不能相比的,但它也是最烦琐和最复杂的检测技术,目前在动物检疫中尚不多采用.
目前应用最多的快速测序技术是Sanger等(1977)提出的双脱氧链终止法.其原理是：核酸模板在核酸聚合酶、引物、四种单脱氧碱基存在条件下复制或转录时,如果在四管反应系统中分别按比例引入四种双脱氧碱基,只要双脱氧碱基掺入链端,该链就停止延长,链端掺入单脱氧碱基的片段可继续延长.如此每管反应体系中便合成以共同引物为5’端,以双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段.反应终止后,分四个泳道进行电泳.以分离长短不一的核酸片段(长度相邻者仅差一个碱基),根据片段3’端的双脱氧碱基,便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序.
(一) Sanger双脱氧链终止法(酶法)测序程序 操作程序是按DNA复制和RNA反转录的原理设计的.
1.分离待测核酸模板,模板可以是DNA,也可以是RNA,可以是双链,也可以是单链.
2.在4只试管中加入适当的引物、模板、4种dNTP(包括放射性标记dATP,例如?32 PdATP和DNA聚合酶（如以RNA为模板,则用反转录酶）,再在上述4只管中分别加入一种一定浓度的ddNTP(双脱氧核苷酸).
3.与单链模板（如以双链作模板,要作变性处理)结合的引物,在DNA聚合酶作用下从5’端向3’端进行延伸反应,32P随着引物延长掺入到新合成链中.当ddNTP掺入时,由于它在3’位置没有羟基,故不与下一个dNTP结合,从而使链延伸终止.ddNTP在不同位置掺入,因而产生一系列不同长度的新的DNA链.
4.用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳同时分离4只反应管中的反应产物,由于每一反应管中只加一种ddNTP(如ddATP),则该管中各种长度的DNA都终止于该种碱基(如A)处.所以凝胶电泳中该泳道不同带的DNA 3’ 末端都为同一种双脱氧碱基.
5.放射自显影.根据四泳道的编号和每个泳道中DNA带的位置直接从自显影图谱上读出与模板链互补的新链序列.
(二) 双脱氧测序的示剂及具体操作步骤（以双链DNA测序为例）.
1.变性双链模板的制备
(1) 材料 Tris/葡萄糖缓冲液(20mmol/L Tris-HCl pH8.0,10mmo1/L EDTA,50mmo1/L 葡萄糖),1％ SDS,0.2mo1/L NaOH,异丙醇,TE缓冲液pH8.0,4mol/L LiCl,冰冷 70％和无水乙醇,2mol/L NaOH,2mmol/L EDTA.
(2) 配制方法
① 取1.5ml处于对数生产期的培养菌液(含有待测病毒核酸的重组质粒模板),离心除去上清液后,用150?l Tris/葡萄糖缓冲液 重悬菌团,在室温下放置5分钟.
② 加入300?l的1％SDS,0.2mol/L NaOH,颠倒混合约15次,在室温下放置15分钟,加入225ml 3mol/L醋酸钠(pH4.5),颠倒约15次混合,在冰浴中放置45分钟,然后离心5分钟.
③ 将650?l上清液转移至一支新管中,加入650?l异丙醇,混合后在室温下放置10分钟,离心5分钟后弃去异丙醇,抽真空干燥沉淀.
④ 用125?l TE(pH 8.0)重新溶解DNA,加入375?l的4mol/L LiCl,在冰浴中放置20分钟后,于4℃下离心5分钟.
⑤ 将上清液转移至一支新管中用饱和苯酚抽提后再用氯仿抽提,加入2倍体积的异丙醇,在室温下沉淀30分钟,离心5分钟,弃去上清液.
⑥ 用冰冷的70％乙醇洗沉淀,离心5分钟,弃去上清液并干燥,用50?l TE缓冲液重新溶解沉淀.用紫外分光光度计测定质粒DNA含量.
⑦ 取0.2?g质粒DNA,并将体积调至9?l,加入1?l 2mol/L NaOH,2mmol/L EDTA,在室温下放置5分钟,加入2?l 30mol/L醋酸钠(pH 4.5)和8?l水.
⑧ 加入6?l冰冷无水乙醇,混合后在干冰／乙醇浴中放置15分钟,在4℃下离心5分钟,小心地弃去上清液,用冰冷的70％乙醇洗沉淀,离心5分钟并小心地弃去上清液,真空抽干沉淀,并用TE缓冲液重新溶解沉淀.
2.延伸和终止反应 以利用T7DNA聚合酶进行的双脱氧链终止反应为例.
(1) 材料 变性的双链DNA模板(溶解在TE缓冲液中),0.5pmol/?L寡核苷酸引物(溶解在TE中,-20℃贮存),5×测序缓冲液(200mmol/L Tris pH7.5,50mmol/L MgCl2,-20℃贮存),0.1mol/l DTT(当月新配-20℃贮存),15pmol/L的3种dNTP混合物(缺dATP),1 000至1 500Ci/mmol ?32p dATP(在－20℃下达4至6周),修饰的T7 DNA聚合酶,标准酶稀释溶液(20mmol/L Tris－HCl pH7.5,0.5mg/mlBSA,10mmol/L ?- 巯基乙醇,4℃贮存),终止混合物(表2-30),甲酰胺上样缓冲液(0.2ml 0.5mol/LEDTA pH8.0,10mg溴酚蓝,10mg二甲苯青,10ml甲酰胺).
表2-30 T7DNA聚合酶终止反应混合物
反应成分 ddG ddA ddT ddC 最终浓度
H2O 15 15 15 15 －
5×测序缓冲液 6 6 6 6 － 1mmol/L
4dNTP 6 6 6 6 200μmol/L
1mmol/L ddGTP 3 － － － 20μmol/L
1mmol/L ddATP － 3 － － 20μmol/L
1mmol/L ddTTP － － 3 － 20μmol/L
1mmol/L ddCTP － － － 3 20μmol/L
(2) 配制方法
① 取4支0.5?l小离心管,标上G、A、T、C,每管加入7?l变性的双链DNA模板(分别为1和2?g),1?l寡核苷酸引物和2?l 5×测序缓冲液混合,65℃保温2分钟,在室温下冷却30分钟.
② 每管加入1?l 0.1mol/L DTT,2?l 1.5mol/L 3种dNTP混合物,0.5?l ?32P dATP和2?l(2IU)修饰的T7DNA多聚酶混合物,在室温下放置5分钟.
③ 按标记每管分别加入3?l 4种ddNTP终止混合物的一种.
④ 短促离心后,在37℃下保温5分钟.
⑤ 加入5ml甲酰胺上样缓冲液,上样前在80℃下加热2分钟,并迅速置于冰浴上,每个样品取3?l,上样电泳.
3.测序反应物电泳和序列读取
(1) 按普通聚丙烯酰胺凝胶制作方法制作梯度胶.
(2) 按G、A、T、C次序加入每种样品,在G、A和T各泳道上样1ml,而在C泳道上样1.5?l.
(3) 上样完毕加压1700V电泳,根据样品中溴酚蓝和二甲苯青染料迁移情况确定电泳时间.
(4) 电泳完毕,在10℃冰醋酸中漂洗30分钟脱去尿素.
(5) 在60℃或80℃干燥30分钟后,放射自显影读取序列.
(三) 研究进展
1.几种快速获取模板的方法
(1) 单链噬菌体系统 利用克隆载体M13噬菌体浸染大肠杆菌,在细菌细胞噬菌体基因组以复制型双链DNA存在,并经滚环式复制产生子代噬菌体正链DNA,同时合成有关蛋白,装配后释放到细胞外.成熟的M13噬菌体含单链DNA,经克隆的筛选、抽提纯化,得到所需模板.
(2) 杂交质粒系统 此系统除具M13系统的功能外,还能作为表达载体直接用于DNA序列分析和基因表达研究.
(3) 直接利用RNA进行序列测定 在杂交质粒的多克隆位点两侧插入一段能被噬菌体 RNA聚合酶识别的启动子,在噬菌体RNA聚合酶的作用下,在体外将克隆的外源双链DNA转录为单链的RNA,以RNA为模板,与引物退火后,在反转录酶(如AMV)作用下,按双脱氧链终止法步骤进行序列分析.
(4) PCR技术的采用 PCR技术的出现,使序列分析用DNA模板的制备更加方便.① 例如用PCR法合成双链DNA片段,直接用双链进行测序.② 在PCR扩增时,两个引物之一的 5’端生物素化,扩增后将DNA变性,通过亲和素柱,分离5’端含生物素的单链.③ 利用不对称PCR,按1:50匹配两引物含量,产生单链DNA.④ GAMTS法,在两个PCR引物之一的 5’端连接噬菌体RNA聚合酶启动子序列,这样经PCR扩增产生的双链DNA片段的一端就带上了该启动子序列.然后以扩增出的双链DNA为模板,在噬菌体RNA聚合酶作用下转录出单链RNA.再以单链RNA为模板进行序列分析.
2.采用高分辨率的凝胶电泳技术
(1) 采用薄胶 凝胶厚度减少到0.5mm或0.1mm,样品泳动加快,自显影时减少?粒子在凝胶中的散射,提高分辨率.
(2) 采用梯度胶 包括离子梯度和浓度梯度,使DNA片段泳动均匀,大小不同而又很相近的大片段更易拉开距离.
(3) 采用鲨鱼齿梳 使相邻泳道相互靠近,不但在自显影图上更易判定相邻带的上下关系,而且可以增加每板凝胶的泳道数目.
3.DNA序列分析自动化
(1) 放射自显影自动读谱仪 在电泳装置中装一个高灵敏度放射性探测仪,在电泳过程中将结果输入计算机,获得分析结果.
(2) 用荧光标记引物或荧光标记ddNTP 可在电泳过程中以激光扫描装置识别DNA条带,经计算机处理后得到序列分析结果.此法适宜大量样品的测序.
自1998年美国塞莱拉遗传公司组建以来,人类基因组研究开始由两部分科学家同时展开,分别是由公共经费支持的人类基因组工程和美国塞莱拉遗传公司.在研究过程中,他们也分别采用了两种不同的测序和分析的方法.塞莱拉公司的核心分析方法被称为"霰弹法",人类基因组工程则采用了"克隆法".
所谓"霰弹法",其实是一种高度计算机化的方法,它先把基因组随机分成已知长度（2000个碱基对、1万个碱基对、5万个碱基对）的片段,然后用数学算法将这些片段组装成毗邻的大段并确定它们在基因组上的正确位置.
塞莱拉公司的科学家先用霰弹法测序DNA,并将整个基因组覆盖8次,然后用两个数学公式将人类基因组序列多次组装起来,确定出基因中的转录单元,预测出60%的已识别基因的分子功能.最后研究人员将人类基因组信息与此前已完成的果蝇和线虫的基因组序列进行比较,从而找出了三者共有的核心功能.
而人类基因组工程采用的"克隆法"则通过先复制更大段的人类基因序列,然后将它们绘制到基因组的适当区域进行研究.这种方法需要研究人员在早期把较多的时间和精力放到克隆和绘制草图上.
两个研究组将所得数据进行对比,经人类基因组工程的科学家、《科学》和《自然》杂志高级指导编辑评估,表明塞莱拉公司的基因组分析与人类基因组工程的分析结果虽然存在一些差异,但大部分地方都有极高的吻合度.
塞莱拉公司测定的序列覆盖了95%以上的人类基因组,其中约85%的人类基因组存在于按照正确顺序排列、至少包含50万个碱基对的片段中.这一序列为人类至少拥有2.6383万个控制合成蛋白质的基因提供了有力的证据,也为另外1.2731万个假设基因的存在提供了较弱的证据.
Margulies等人发明了一种平行的而且简单的DNA测序系统.这种测序系统能够在4小时左右的时间里以99％以上的准确率测定250万碱基对.在技术水平上,这种方法的测序速度比传统的Sanger测序法提高了大约100倍.这种方法的一个重要的技术优势在于样品的制备.通过断裂基因组得到的短的DNA随机片断的文库被吸附在念珠上,然后被乳化（emulsified）,进入发应孔（reaction wells）中扩增和测序,因此不需要亚克隆（subclone）每个片断.为了验证这种方法的准确性,研究者用鸟枪法（shotgun sequencing）测序并重新拼接了生殖器支原体的基因组（Mycoplasma genitalium genome）（0.58megabase）.新方法测序结果覆盖了96％,准确率达到了99.96%.在以肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）的基因组（2.1megabase）为样本时得到了同样的结果.
2001年人类基因组序列草图的发表使得两种不同测序方法形成鲜明对比.“私人”Celera序列采用“全基因组随机”法,即把基因组切成小DNA片段,对其各自进行测序,然后根据基因重叠将它们重新排序；“公共”序列采用“克隆顺序”法来对一个染色体上已知位置的大块DNA进行测序.公共测序工作在今后项目中也将采用随机方法,所以了解随机方法的测序能力至关重要.研究人员对最近的序列（公共版本的“Build34”）做了比较,发现随机方法的主要局限性是片段复制不够清楚.在很多情况下,复制是不存在的,导致对基因组大小的估计过低.但这一比较的确为怎样改进算法和杂合策略、以恢复“困难”区域提供了线索.