biospin 质粒DNA小量提取试剂盒中有瓶试剂叫wash buffer,需要加入无水乙醇,请问加入无水乙醇的作用是什么?今天做胶回收的时候不小心选择了没有加无水乙醇的试剂,做胶回收的wash buffer 和提质

biospin 质粒DNA小量提取试剂盒中有瓶试剂叫wash buffer,需要加入无水乙醇,请问加入无水乙醇的作用是什么?今天做胶回收的时候不小心选择了没有加无水乙醇的试剂,做胶回收的wash buffer 和提质
biospin 质粒DNA小量提取试剂盒中有瓶试剂叫wash buffer,需要加入无水乙醇,请问加入无水乙醇的作用是什么?
今天做胶回收的时候不小心选择了没有加无水乙醇的试剂,做胶回收的wash buffer 和提质粒用的应该是一样的吧.
使用此试剂盒提取质粒时是是如何分离质粒和基因组DNA的?

biospin 质粒DNA小量提取试剂盒中有瓶试剂叫wash buffer,需要加入无水乙醇,请问加入无水乙醇的作用是什么?今天做胶回收的时候不小心选择了没有加无水乙醇的试剂,做胶回收的wash buffer 和提质
1.wash buffer中加入无水乙醇后,终浓度差不多就是70%的乙醇溶液了,在沉淀的DNA中,由于过多的盐杂质存在,影响DNA的酶切等反应,wash buffer就是洗去这些盐杂质的.
2.用无水乙醇沉淀DNA,这是实验中最常用的沉淀DNA的方法.乙醇的优点是可以任意比和水相混溶,乙醇与核酸不会起任何化学反应,对DNA很安全,因此是理想的沉淀剂.DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在,当加入乙醇时,乙醇会夺去DNA周围的水分子,使DNA失水而易于聚合.一般实验中,是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合,其乙醇的最终含量占67％左右.因而也可改用95％乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比95％乙醇昂贵）.但是加95％的乙醇使总体积增大,而DNA在溶液中有一定程度的溶解,因而DNA损失也增大,尤其用多次乙醇沉淀时,就会影响收得率.折中的做法是初次沉淀DNA时可用95％乙醇代替无水乙酵,最后的沉淀步骤要使用无水乙醇.也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA.一般在室温下放置15－30分钟即可.如果你没有加无水乙醇,核酸不能沉淀,都随洗液弃掉了.
3.十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS）,钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS,而高浓度 的盐,使得沉淀更完全.大家知道SDS专门喜欢和蛋白质结合,平均两个氨基酸上结合一个SDS分子,钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质 沉淀了,让人高兴的是大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了.这个过程不难想象,因为基因组DNA太长了,长长的DNA自然容易被PDS给共沉淀了,尽管SDS并不与DNA分子结合.
需要特别说明的是：醋酸的加入是为了中和NaOH,因为长时间的碱性条件会打断DNA,所以要中和之.基因组DNA一旦发生断裂,只要是50－100 kb大小的片断,就没有办法再被PDS共沉淀了.所以碱处理的时间要短,而且不得激烈振荡,不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入.

一、乙醇是核算的沉淀剂，也可以洗脱醇溶性杂质。
二、应该没法补救了。一样的。
三、基因组DNA分子很大链很长，在起初的蛋白质沉淀时，绝大部分已经缠绕在一起沉淀下去了，此外，试剂盒中套管中的纤维膜只能特异的吸附几百至几千bp的DNA片段，小的不能吸附，大的不能被洗脱下去，因此可以很好分离大分子量的基因组DNA和较小分子量的质粒DNA...

全部展开

一、乙醇是核算的沉淀剂，也可以洗脱醇溶性杂质。
二、应该没法补救了。一样的。
三、基因组DNA分子很大链很长，在起初的蛋白质沉淀时，绝大部分已经缠绕在一起沉淀下去了，此外，试剂盒中套管中的纤维膜只能特异的吸附几百至几千bp的DNA片段，小的不能吸附，大的不能被洗脱下去，因此可以很好分离大分子量的基因组DNA和较小分子量的质粒DNA

收起

wash buffer其实是70%的无水乙醇，其目的是“wash”，也就是洗去柱子上残余的盐分其他成分。
没有加无水乙醇，那就悲剧了，柱子上的DNA在这一步已经被洗的差不多了，都脱下了。做胶回收的wash buffer应该是成分类似，但不同公司，或不同的柱芯，其成分可能有差异。
使用试剂盒提取质粒，分离基因组DNA，其原理还是碱裂解法的原理：当菌体在NaOH和 SDS溶液中裂解时，...

全部展开

wash buffer其实是70%的无水乙醇，其目的是“wash”，也就是洗去柱子上残余的盐分其他成分。
没有加无水乙醇，那就悲剧了，柱子上的DNA在这一步已经被洗的差不多了，都脱下了。做胶回收的wash buffer应该是成分类似，但不同公司，或不同的柱芯，其成分可能有差异。
使用试剂盒提取质粒，分离基因组DNA，其原理还是碱裂解法的原理：当菌体在NaOH和 SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性 而呈絮状，离心时可沉淀下来。

收起