western blot!拜托各位大侠看看我跑出这个条带到底是什么问题啊.我先说下我的条件：跑的蛋白44KD,胶的浓度分别是5%和12%.转膜：湿转 1.5h,0.25A封闭：5%脱脂牛奶2h ,室温一抗：1:500 4°过夜二抗：1

来源：学生作业帮助网 编辑：六六作业网 时间：2024/11/26 02:33:17
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western blot!拜托各位大侠看看我跑出这个条带到底是什么问题啊.
我先说下我的条件：
跑的蛋白44KD,胶的浓度分别是5%和12%.
转膜：湿转 1.5h,0.25A
封闭：5%脱脂牛奶2h ,室温
一抗：1:500 4°过夜
二抗：1:10000 37° 1h
曝光完以后,有很高的背景,并且条带不清晰.但是之前做出来过.不知问题出在哪?

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转膜电流太大了,有可能是转过了,建议你用丽春红染下膜,看看蛋白条带是否清晰.我一般用恒压75V,这样子电流只有一百多毫安,差不多也就是五十多KD的蛋白；背景高的话可以加大脱脂奶粉的浓度,用7.5%的,另外脱脂奶粉里可以再加入0.5%的二抗来源动物的血清,漂洗要彻底,TBST 10min 4次.不知你用的是哪个公司的抗体,我的一抗一般都是1:2000-1:5000,可能你抗体浓度也高了,但是你的目的条带并不清楚,所以也不敢确定.你可以尝试改一下条件,如果还不好的话,很有可能是你抗体的原因了.
WB就是很奇怪,一次做出来不一定次次都能出来

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