在PCR技术发明以前,人们是怎么做分子克隆的?限制性内切酶是70年代发现的PCR是83年才发明的今天在做实验的时候突然想,没有PCR的时候,研究者是怎么克隆基因的呢?但是PCR技术之前就有基因克

在PCR技术发明以前,人们是怎么做分子克隆的?限制性内切酶是70年代发现的PCR是83年才发明的今天在做实验的时候突然想,没有PCR的时候,研究者是怎么克隆基因的呢?但是PCR技术之前就有基因克
在PCR技术发明以前,人们是怎么做分子克隆的?
限制性内切酶是70年代发现的
PCR是83年才发明的
今天在做实验的时候突然想,没有PCR的时候,研究者是怎么克隆基因的呢?
但是PCR技术之前就有基因克隆，他们是怎么完成这个过程的呢？

在PCR技术发明以前,人们是怎么做分子克隆的?限制性内切酶是70年代发现的PCR是83年才发明的今天在做实验的时候突然想,没有PCR的时候,研究者是怎么克隆基因的呢?但是PCR技术之前就有基因克
70年以前没有什么基因克隆方面的研究成果,在1975年英国生物化学家桑格（F.Sanger）建立了“加减法”后,才有一些关于测序方面的研究,基因工程才真正的达到了分子水平.

在那段时间之前主要的研究重点是遗传物质，当发现DNA市遗传物质的时候才对DNA解构进行重点研究，才有了基因的研究，然后发现了酶切，才可以进行分子克隆，当发现taq酶的时候才有了PCR方法的发现。

加减法是测序的~
科恩伯格最引人注目的研究工作，是在20世纪50年代中期用实验证明DNA的复制并分离了复制所需的酶，这集中反映在他于1956年发表的著名论文《脱氧核糖核酸的酶促合成》一文中，他因此于1959年获得诺贝尔生理学和医学奖。?
在1953年以前，基因的物质本性一直是困扰着全世界生物学家的问题。1953年4月25日《自然》杂志发表了沃森（J. Watson）和克...

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加减法是测序的~
科恩伯格最引人注目的研究工作，是在20世纪50年代中期用实验证明DNA的复制并分离了复制所需的酶，这集中反映在他于1956年发表的著名论文《脱氧核糖核酸的酶促合成》一文中，他因此于1959年获得诺贝尔生理学和医学奖。?
在1953年以前，基因的物质本性一直是困扰着全世界生物学家的问题。1953年4月25日《自然》杂志发表了沃森（J. Watson）和克里克（F. Crick）的DNA双螺旋结构模型，既反映了DNA分子可能具有的无穷多样性，又能立刻提出DNA分子自我复制的可能机制，使生物学家一下子接受基因的物质本性就是DNA。但是，DNA双螺旋结构模型虽然是以众多的实验结果为依据，但它本身却尚有待于实验证明。尤其是，DNA果真是一种能自我复制的分子吗？在DNA双螺旋结构模型发表之后，科恩伯格就以这一模型作为设想基础，用实验方法研究DNA的复制，很快得到成功，于1956年发表了初步结果。他成功的原因之一在于他有一个正确的分析：他觉得构成DNA分子的单体虽然是4种脱氧核苷一磷酸，但是，DNA合成的原料却不是4种脱氧核苷一磷酸，而是4种脱氧核苷三磷酸。4种脱氧核苷三磷酸缺1种都不行，用4种脱氧核苷二磷酸或4种脱氧核苷一磷酸也都不行。他还设想，细胞内必有合成DNA所需的酶。于是他把大肠杆菌磨碎，用其提取液加上4种脱氧核苷三磷酸（其中至少有1种进行放射性同位素标记，以便于检查实验结果），再加一点点微量DNA作为“模板”（如小牛胸腺DNA、大肠杆菌DNA以及大肠杆菌T2噬菌体DNA）。把上述混合液在有镁离子存在的条件下于37℃静置30min，发现放射性标记已进入DNA部分，说明有新合成的DNA分子。新合成的DNA分子即实验产物可以用过氯沉淀法同作为原料的脱氧核苷三磷酸单体分开。科恩伯格测定了产物DNA的碱基组成，发现它们同各自的模板DNA组成惊人地相似, 这就充分证明新合成的DNA的特异性是由所加入的那一点点微量的模板DNA决定的，只不过数量大大增加了而已。DNA果然是一种能自我复制的分子！
? 这里插叙一下，人们后来知道DNA合成还需要“引物”以提供3′端羟基，使DNA聚合酶得以从该处将一个个脱氧核苷酸聚合而成DNA。科恩伯格当年在制备模板DNA时进行了化学处理，造成了一些断裂，从而形成了一些现成的3′端羟基。这一点在当时是不知道的。? 科恩伯格在获得诺贝尔奖后没有止步不前。他清楚地知道，他在体外合成的DNA是没有活性的。那么，能不能在体外合成有活性的DNA分子呢？1967年，他以大肠杆菌φⅩ174噬菌体DNA为材料进行体外复制实验。φⅩ174的基因组是单链环状DNA，共5 386个核苷酸。细胞内的情况是：当φⅩ174感染大肠杆菌时，单链环状DNA进入细菌，很快就按碱基配对原则合成其互补链，构成双链环状的“复制形式DNA”。一般把噬菌体颗粒中的单链称为“+链”，进入细菌后合成的互补链称为“-链”。在细菌内复制时，是以-链为模板，按“滚环” 方式合成许多个+链。这些+链与蛋白外壳构建成新的φⅩ174从细菌内释放出来。科恩伯格基本上仍用1956年所用的方法（但增加了连接酶，使新合成链的最后一个核苷酸的3′ 端羟基和最初第一个核苷酸的5′ 端磷酸基连接起来形成环状）,以φⅩ174+链DNA为模板，在体外合成-链，又以-链为模板，在体外合成+链。体外合成的φⅩ174+链DNA能感染大肠杆菌，在细菌内能复制，最后从细菌内释放出许多φⅩ174噬菌体颗粒，具有原来φⅩ174噬菌体的全部特性。由此，人类首次在试管内合成了具有生物学活性的DNA分子。 科恩伯格在DNA体外合成方面所取得的成就，其影响极为深远。首先是关于DNA复制所需的酶。?
科恩伯格开始实验时所设想的大肠杆菌提取液中含有的DNA聚合酶，在1957年就被他分离纯化，那就是至今仍在全世界各个分子遗传学实验室里经常使用的“大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ”，又称“科恩伯格酶”。它既具有聚合酶的活性，又具有5′→3′ 外切酶和3′→5′外切酶的活性。今天我们用DNA分子杂交技术进行基因分离、基因结构分析、基因诊断等研究时要用放射性同位素标记的基因探针；标记基因探针常用的“缺刻前移法”（nick translation）就是利用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ兼有聚合酶活性和5′→3′ 外切酶活性这一特点，而其反应过程也就是科恩伯格当年进行的DNA体外合成的过程。所以，尽管后来证明在大肠杆菌细胞内复制时起主要聚合作用的是大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ，不是DNA聚合酶Ⅰ，但在分子遗传学实验室里，大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的重要性却处于实验室常用酶的最前列。?
1970年，丹麦生物化学家克莱诺夫（H.Klenow）用枯草杆菌蛋白酶切割大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ，电泳后获得大小两个片段。大片段保留了聚合酶和3′→5′外切酶活性，但丧失了5′→3′ 外切酶活性，被称为“克莱诺夫片段”，又称“克莱诺夫酶”。标记基因探针常用的另一种“随机引物法”（random priming）就必须用克莱诺夫酶而不能用科恩伯格酶。其次，科恩伯格的成就还直接导致了一些诺贝尔奖的获奖项目。?
到目前为止，包括2003年4月完成的“人基因组计划” 在内，已有超过1000种的噬菌体、病毒、类病毒、细菌、原始细菌、真菌、植物、动物以及细胞器和质粒的基因组DNA全核苷酸序列被测定。DNA测序起始于英国生物化学家桑格（F. Sanger）在1975年建立的“加减法”以及他用该法在1977年首次测定了φⅩ174基因组DNA的全核苷酸序列。近30年来，DNA测序由半自动化发展到全部由仪器自动测序，但其基本原理仍然没有跳出桑格“加减法” 的范畴，而“加减法” 的“源头” 则是科恩伯格的DNA体外合成实验。它是设法控制DNA酶促合成反应，使之产生不同长度的互补链，从而测定一个一个核苷酸的排列顺序。其中， 所用的DNA聚合酶正是克莱诺夫酶。桑格因建立DNA测序方法而获得1980年诺贝尔化学奖。?

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