PCR-SSCP原理和操作步骤怎么做,主要分析多态性
来源：学生作业帮助网 编辑：六六作业网 时间：2024/11/25 04:37:41
PCR-SSCP原理和操作步骤怎么做,主要分析多态性
PCR-SSCP原理和操作步骤
怎么做,主要分析多态性
PCR-SSCP原理和操作步骤怎么做,主要分析多态性
原理：PCR-SSCP是1989年日本Orita等创建的筛查突变的新技术.它是一种简单、快速、经济的点突变筛查手段.PCR-SSCP技术的基本原理是PCR扩增后的DNA片段经变性成单链DNA,单链DNA在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时形成不同的立体构象,其构象直接影响泳动速率,相同长度的 DNA单链其核苷酸顺序仅有单个碱基的差别,就可以产生立体构象的不同,造成泳动速率的不同,产生不同的泳动带.PCR扩增后的DNA片段经变性成单链后在不含有变性剂的中性胶中电泳,与正常比较出现泳动带的变位即可推测存在碱基置换.其碱基置换的性质必须经过DNA测序才能确定.因此PCR-SSCP检测是测序之前突变筛查的常用手段.
为了便于观察分析结果,PCR扩增体系中常加入a-32P dNTP标记PCR产物,电泳后放射自显影观察泳动带的位置.目前也常用银染法来染色聚丙烯酰胺凝胶上的DNA泳动带,此方法可避免同位素的污染及对操作者的辐射损伤,但其灵敏度不如用同位素标记.
单链DNA片段的立体构象主要与碱基序列相关,但也受到其他条件的影响.因此,PCR-SSCP技术的关键在于电泳时的诸多条件,如凝胶的组成、电泳的温度、离子浓度以及影响分子内相互作用的其他溶质等.
PCR-SSCP的缺点是存在假阴性和假阳性,一般对长度不超过300bp的待测片段的检出率为70~80%.
步骤
1．PCR反应（同前）
PCR产物经琼脂糖电泳确认.
2．PCR反应结束后,取5μl扩增产物加10μl甲酰胺上样缓冲液混匀,98℃ 变性10分钟,迅速冰浴.
3．非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
3.1 制备50ml 6%非变性聚丙烯酰胺凝胶,加 TEMED 25μl、10%过硫酸铵250μl,混匀后灌胶,插入加样梳子.待胶完全聚合后,拔出加样梳子,安装电泳装置,加入1´TBE电泳缓冲液,缓冲液应高于加样孔上缘,用注射器吸取缓冲液冲净加样孔.
3.2 取已变性的5μl PCR扩增产物加到点样孔中,以200V/cm电泳 5小时.
3.3 拆下电泳装置,取出聚丙烯酰胺凝胶,放到一个塑料盘内,用蒸馏水冲洗1~2遍.
3.4 倒入固定液,固定 10分钟.
3.5 用蒸馏水冲洗1~2遍；倒入银染液,银染10~12分钟.
3.6 用蒸馏水冲洗若干遍；倒入显色液,显色至出现清晰的银染带.
3.7 用蒸馏水浸泡聚丙烯酰胺凝胶,观察PCR-SSCP结果.