考研题 微生物 请高人帮忙 先谢了 有一段已知序列的小分子抗菌肽,论述如何采用生物工程的技术进行表达?
来源：学生作业帮助网 编辑：六六作业网 时间：2024/12/24 22:17:48
考研题 微生物 请高人帮忙 先谢了 有一段已知序列的小分子抗菌肽,论述如何采用生物工程的技术进行表达?
考研题 微生物 请高人帮忙 先谢了 有一段已知序列的小分子抗菌肽,论述如何采用生物工程的技术进行表达?
考研题 微生物 请高人帮忙 先谢了 有一段已知序列的小分子抗菌肽,论述如何采用生物工程的技术进行表达?
这是一道论述题,我自己按照我的理解给你回答一下吧,希望能够给你一些帮助
首先要知道抗菌肽的表达系统是真核的还是原核的,答题的思路是：
1、利用genbank搜索已知序列,如果没有则需要自行测序
2、分别测出N端和C端个15个氨基酸序列,利用密码子简并性和偏爱性设计引物
3、引物设计出来以后抽提总RNA,用RT-PCR对抗菌肽对应的基因进行扩增.
4、测序,将目的基因连接到T载体上,转化入克隆菌（如TG1）,蓝白斑筛选,用PCR和酶切鉴定重组结果,获得重组质粒后,以此为模板进行测序,验证目的基因的准确性.
5、选择适合的表达系统和适合的载体.可采用大肠杆菌原核表达系统,将目的基因从与T载体的重组质粒上进行双酶切后连接到适合的载体（如pET28a）上,转化入克隆菌（如TG1）并大量克隆,用酶切和PCR鉴定重组结果.也可采用真核表达系统,若改小分子抗菌肽是真核表达的蛋白,易糖基化、易翻译后修饰,则用原核表达系统难以表达天然产物结构功能相似的蛋白.故采用真核表达系统.通过位点特异的转座可方便地将外源基因插入到病毒穿梭载体上,然后提取含有外源基因的重组DNA,将其转染昆虫细胞即可获得含有外源基因的重组病毒用于表达目的蛋白.
6、产物的表达、分离和纯化.原核表达系统,是将重组质粒转化到合适的大肠杆菌表达菌（如BL21、BL21*等）中,加IPTG诱导剂进行诱导表达,经SDS-PAGE电泳鉴定表达产物后,通过超声诱导菌,将上清和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳,确定蛋白是上清蛋白还是包涵体,之后根据蛋白表达的方式可采取相应的方法进行目的蛋白的分离和纯化.也可利用含有外源基因的家蚕杆状病毒感染家蚕幼虫或蛹进行真核表达,表达的蛋白具有天然活性.
7、确定活性一致.使用免疫学手段,给成年新西兰兔多次皮下注射乳化好的纯化后蛋白,获得相应抗体,用Western blot和Elisa的方法,目的蛋白和抗体会发生特异性结合,并用Elisa检测抗体的效价,以此确定活性一致.
以上纯手打,希望能给你一些帮助.