慢病毒转染细胞,如何测moi值
来源：学生作业帮助网 编辑：六六作业网 时间：2024/11/24 21:49:46
慢病毒转染细胞,如何测moi值
慢病毒转染细胞,如何测moi值
慢病毒转染细胞,如何测moi值
细胞系预实验-MOI 的确定
预实验的目的是了解所操作细胞被慢病毒载体感染的容易程度,另一方面在一些情况下虽然慢病毒已经感染进入细胞,但由于表达标记基因的启动子在该细胞内的表达效率不高,没能观察到感染现象.我们在预实验方案中加入不同启动子的病毒进行感染,并且用定量PCR测定感染后细胞内整合病毒,这样即使病毒没有表达也可以观察感染.
1.感染前一天接种,使得第二天细胞汇合度为30-40%.培养板可以是96孔板（只通过显微镜观察荧光）或是24孔板（通过流式或是定量PCR确定感染比例）.
2.设置不同MOI值的感染组,通常设立1,2,5,10,20,50,100的感染组别,各做两个孔,一个孔中加入终浓度为5 μg/ml的polybrene,另一组不加.Polybrene可以促进病毒对细胞的侵染,但在少数情况下它对细胞有伤害.常用的对照病毒包括CMV-GFP,EF1a-GFP,UbiC-GFP,PGK-GFP.一般细胞里面CMV启动子的表达活性是最强的,但在血液来源的一些癌细胞中EF1a的表现要优于CMV.UbiC在一般细胞中都表达,但表达活性一般要低一些,它在神经元等原代细胞的感染中是最好的.
3.12-24小时后,将培养上清丢掉同时除去没有感染细胞的病毒,更换为新鲜的培养基.
4.感染3-4天后可以在荧光显微镜下观察,细胞应当会被感染并表达荧光.细胞感染的比例可以通过拍照目测估计或是根据图片数数计算.
5.如果是用24孔板做的预实验,则可以用消化液将细胞消化成单个,通过流式细胞法得到每个感染复数下被感染细胞比例,此时注意设置空细胞组用于对照.
6.也可以将消化下来的细胞抽提基因组DNA,用滴度测定中介绍的定量PCR方法得到整合病毒和细胞的比例.注意如果是所感染为动物细胞则需要用相应物种的内参基因.
当后期实验用的细胞培养面积与预实验不同时,则需要放大感染系统.实验体系放大的原则是保持细胞的密度一致,按照底面积增加病毒用量,同时保持培养基和底面积的比例就可以达到与预实验一致的感染效果.当细胞密度与预实验有出入时,如果细胞密度变大,则相应增加病毒用量,如果细胞密度变小,则保持病毒用量不变.