简述石蜡切片术的制作过程

简述石蜡切片术的制作过程
简述石蜡切片术的制作过程

简述石蜡切片术的制作过程
光学显微标本的制作技术
【实验目的】
了解光学显微镜切片制作技术的基本方法步骤.
【实验原理】
采用光学显微镜研究一般生物体的内部结构,在自然状态下是无法观察清楚的,多数动、植物材料都必须经过某种处理,将组织分离成单个细胞或薄片,光线才能通过细胞.为了适应这个需要,就产生了光学显微镜制片技术.
光学显微镜的制片技术方法可分为两大类：一类是非切片法,另一类是切片法.
非切片法,是用物理或化学的方法,使细胞彼此分离,如有分离法、涂布法、压碎法等.非切片法的操作比较简单,能保侍细胞的完整,但是细胞之间的正常位置往往被更动,无法反映细胞之间的正常联系.它可以与切片法配合使用,各取其长处.
切片法,是利用锐利的刃具将组织切成极薄的片层,材料须经过一系列特殊的处理,如固定、脱水、包埋、切片、染色等,过程十分繁复.在制作过程中,还要经过一系列的物理和化学的处理,这些处理方法可根据各种不同材料的性质要求进行合理选择.切片法虽然工序繁琐,技术复杂,但是,它最能保持细胞间的正常的相互关系,能较好和较长时间地保留细胞的原貌,所以仍然是光学显微镜的主要制片方法.
【实验仪器、材料和试剂】
（一）仪器：石蜡切片机、恒温蜡箱、载玻片、盖玻片
（二）材料：洋葱根或小鼠肝
（三）试剂：乙醚、无水乙醇、甲醛、冰醋酸、苦味酸、重铬酸钾、锇酸、正丁醇、二甲苯、石蜡、甘油、鸡蛋、纱布、加拿大树胶、麝香草酚
【方法与步骤】
光学显微镜切片制作技术最简单的切片法是徒手切片,但是由于组织块往往十分柔软,
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切削很困难,而且无法得到十分菲薄的切片,因此必须先用某些特殊物质渗入组织块的内部起支持作用,并将整个组织块包住,然后再用精密的切片机制作切片,才能获得良好的效果.这种方法称为包埋法,包埋的物质称为包埋剂.常用的包埋剂有石蜡、火棉胶、炭蜡、明胶等,水和塑料也可作为包埋剂.根据包埋剂的不同,分别有石蜡切片、火棉胶切片、冰冻切片等,它们各有长处,可以根据需要选用,但是使用得最多的还是石蜡切片技术.
石蜡作为包埋剂,有其独特的优点,例如：石蜡能切出极薄的蜡片（2～10μm）；切片时能连成蜡带,便于制作连续切片；操作较容易,组织块可以包埋在石蜡中长期保存.然而石蜡切片的制作过程较长,步骤很多,一步不慎往往导致前功尽弃,而且这些处理引起组织块或多或少地收缩,切片时受湿度影响比较大,这些不足之处必须在制片过程中认真对待,尽量减小它的不良影响.
石蜡切片的制作过程主要包括：取材,固定,脱水,透明,透蜡,包埋,切片,贴片,染色,透明,封藏等步骤.
1．取材
材料的好坏直接影响到切片的质量,无论取哪一种动植物材料,以下几点是必须注意的.
（1）植物材料选择时须尽可能不损伤植物体或所需要的部分；动物材料取用时常对动物施以麻醉,常用的麻醉剂有氯仿和乙醚,或将动物杀死后迅速取出所需要的组织.
（2）取材必须新鲜,这一点对于从事细胞生物学研究尤为重要,应该尽可能割取生活着的组织块,并随即投入固定液.
（3）切取材料时刀要锐利,避免因挤压细胞使其受到损伤.
（4）切取的材料应该小而薄,便于固定剂迅速渗入内部.一般厚度不超过2mm,大小不超过5×5mm2.
2．固定
组织和细胞离开机体后,在一定时间内仍然延续着生命活动,会引起病理变化直至归于死亡.为了使标本能反映它生前的正常状态,必须尽早地用某些化学药品迅速地杀死组织和细胞,阻抑上述变化,并将结构成分转化为不溶性物质,防止某些结构的溶化和消失.这种处理就是固定.除了上述作用外,固定剂会使组织适当硬化以便于随后的处理,还会改变细胞内部的折射系数并使某些部分易于染色.
固定剂的作用对象主要是蛋白质,至于其他成分如脂肪和糖,在一般制作时不加考虑,如要观察这些物质,可用特殊的方法将其固定下来.
固定剂的作用表现在对材料体积的改变、硬化的程度、穿透的速度以及对染色的影响等方面.这些作用的好坏、大小,都依所固定的材料性质而定,同样一种固定液对某一材料来说是良好的,但对另外一些组织可能就不很适用.良好的固定剂必须具备的特征是：穿透组织的速度快.,能将细胞中的内含物凝固成不溶解物质,不使组织膨胀或收缩以保持原形,硬化组织的程度适中,增加细胞内含物的折光度,增加媒染和染色能力,具有保存剂作用. 固定剂有简单固定剂和混合固定剂的划分.
简单固定剂即单一的固定剂,常用的有乙醇、甲醛、冰醋酸、升汞、苦味酸、铬酸、重铬酸钾和锇酸.其中,苦味酸、升汞、铬酸既能凝固细胞清蛋白,又能凝固核蛋白；乙醇只能凝固清蛋白,而醋酸只能凝固核蛋白；甲醛、饿酸和重铬酸钾对这两种蛋白质都不凝固.
简单固定剂的局限性较大,如将其适当混合,制成复合固定剂可以取得更好的效果.常用的混合固定剂有：
Bouin液（70份苦味酸饱和水溶液+25份4％甲醛+5份冰醋酸）、Zenker液（升汞5g＋重铬酸钾2.5g＋硫酸钠1.0g＋5ml冰醋酸＋100ml蒸镏水）、Carnoy改良液（3份无水乙醇+1份冰醋酸）等.固定剂的种类甚多,我们必须依据各种固定剂的性能及制片的不同要求来加以选择. 19
固定时,须注意以下几点：
（1）固定剂应有足够的量,一般为组织块体积的10～15倍.
（2）如所固定的材料外表有不易穿透的物质,可将材料先在含乙醇的溶液中固定几分钟,再移入水溶性的固定液.
（3）材料固定后如不立即下沉,可将其中气泡抽出.
（4）固定时间依材料大小、固定剂种类而异,可从1小时到几十小时,有时中间需要更新固定剂.某些固定剂对组织的硬化作用较强,作用时间应严加控制,不能过长.
（5）一般固定剂都以新配制的为好,用过的不能再用.有些混合固定剂由甲、乙两液合并者,一定要在使用前才混合.
（6）固定完毕,根据所用固定剂的不同,用水或乙醇冲掉残留的固定剂,以免固定剂形成沉淀,影响以后组织块的染色.
3．脱水
生物组织中含有大量的水分,它和石蜡是不能相溶的,致使在包埋时石蜡无法渗入组织内部,因此须使用脱水剂将水分除尽,这就是脱水的作用.
脱水剂必须能与水以任何比例相混合.脱水剂有两类：一类是非石蜡溶剂,如乙醇、丙酮等,脱水后必须再经过透明,才能透蜡包埋；另一类是兼石蜡溶剂,如正丁醇,脱水后即可直接透蜡.
常用的脱水剂是乙醇,因为它价格便宜,易于得到.为了避免剧烈的扩散引起的组织的强烈收缩,脱水步骤应从低到高以一定的浓度梯度来进行,一般组织从30％乙醇开始,经过50％、70％、80％、95％、100％至完全脱水；对于一些柔软的组织应从15％开始.脱水时间依据组织的类型和大小而定,一般各级乙醇中放置45min到1h,如果中间须停顿,应使材料停留在70％乙醇中,因为低浓度乙醇易使组织变软、解体,高浓度乙醇有脆化组织作用,放置时间不能过长,另外,脱水必须在有盖瓶中进行,以防止高浓度乙醇吸收空气中水分导致浓度降低而使脱水不彻底.需要保存的材料可脱水至70%乙醇时停留其中,如需长期保存,可加入等量的甘油.
丙酮也是很好的脱水剂,其作用和用法与乙醇相同,不过其脱水力和收缩力都比乙醇强.
甘油常用于藻类、菌类及柔弱材料的脱水.
二氧六环为无色的石蜡溶剂,对组织没有收缩及硬化等不良后果,但其蒸气有毒,使用时须小心.
正丁醇可与水及乙醇混合,亦为石蜡溶剂,其优点是很少引起组织块的收缩与变脆.
叔丁醇的性质、作用和用法同于正丁醇,但因其价格昂贵而很少使用.
4．透明
组织块用非石蜡溶剂脱水后必须经过透明.透明剂能同时与脱水剂和石蜡混合,它取代了脱水剂后,石蜡便能顺利地渗入组织.
透明剂的种类很多,较常用的是二甲苯、甲苯、苯、氯仿、香柏油和苯胺油等.
二甲苯作用较快,透明力强,但组织块在其中停留过久,容易收缩变脆变硬,同时若脱水不净,就会引起不良后果,在应用时必须特别小心.通常将组织块先经纯乙醇与二甲苯的等体积混合液,再进入纯二甲苯,这样可减少上述的缺点.透明时间应由组织大小而定,—般各级停留时间在30min至2h,在纯二甲苯中应更换2次,总时间则以不超过3h为宜.材料经过透明,会显示出前一步脱水的效果如何,若脱水彻底,组织则显现透明状态,如组织中有白色云雾状,说明脱水不净,须返工处理,但返工的效果往往不好.使用二甲苯透明时,应避免其挥发和吸收空气中的水分,并保持其无水状态. 20
甲苯的一般性质与二甲苯相似.用法亦同,唯沸点较低,透明较慢,但不会使组织变脆.
苯的用法同于二甲苯,对组织的收缩作用小,但须警惕其爆炸和吸入而引起中毒.氯仿适于大块组织的透明.
5．透蜡和包埋
包埋用的石蜡,熔点在50～60℃之间,应根据材料本身的硬度、切片的厚薄和当时的气温条件来选用.一般动物材料最常用的石蜡熔点为52～56℃,植物材料的用54～58℃的；切片薄的用58～60℃的,切片厚的则用52～54℃的；室温10～19℃时选用52～54℃的石蜡可顺利切片,冬季可用熔点46～48℃的石蜡,夏季可选56～58℃的.
石蜡的优劣与切片的成败密切相关.鉴别石蜡质量的方法是：将石蜡熔化后倒入纸盒使其凝结且无气泡和裂痕,30～35℃放置24h且无气泡和不透明的晶状小点出现,蜡块裂面不呈颗粒状,切成薄片不碎成细粒.这种石蜡即为品质优良.含有杂质的新蜡或用过的废蜡可清洁后再用,方法是将石蜡放入锅内,加热到开始冒白烟,然后用小火继续加热30min（注意别超过发火点）,使其去除水分和挥发性杂质,并在温箱中过滤以去除灰尘等颗粒.
透蜡须在恒温箱中进行,恒温箱的温度调节至高于石蜡熔点3度,使经过透明的组织块依次用石蜡与二甲苯的等量混合液、纯石蜡处理.纯石蜡应处理2～3次,透蜡的时间依材料性质而定,一般每次需15～30min.
透明的关键是控制温度的恒定,切忌忽高忽低,温度过低石蜡凝固无法渗透,温度过高使组织收缩发脆.
包埋是使浸透蜡的组织块包裹在石蜡中.具体做法是；先准备好纸盒（具体折法见图1-3及说明）,将熔蜡倒入盒内,迅速用预温的镊子夹取组织块平放在纸盒底部,切面朝下,再轻轻提起纸盒,平放在冷水中,待表面石蜡凝固后立即将纸盒按入水中,使其迅速冷却凝固,30min后取出.
包埋用蜡的温度应略高于透蜡温度,保证组织块与周围石蜡完全融为一体.石蜡的迅速冷却也很重要,否则包埋块中将会产生结晶.以后切片时引起碎裂.
6．切片
（1）石蜡块的固着与整修
在包埋以后,就可进行切片.包埋好的石蜡块装上切片机进行切片前还须进行固着和整修.
固着：一般旋转式切片机上都附有可固着石蜡块的金属小盘,这也可用同样大小的台木替代.用加热的蜡铲将包埋块粘贴于固着物上,并使组织块朝外,便于以后迅速切出所需的片子.
整修：用加热的蜡铲或刀片将固着的包埋块四周修平,使上下两面修成平行面,常保留组织周围附着宽2～3mm的石蜡,而修好的蜡块呈长方形.还可削去一角以便于在蜡带上识别切片.
（2）切片机和切片刀
切片机是用来作各种组织切片的一种专门设计的精密机械,常用的是旋转式切片机,它的夹物部分是上下移动前后推进的,而夹刀部分则固定不动.主要部件是安装切片刀的刀台、安装包埋块的标本台和控制切片厚度的微动装置.切片时切片刀固定不动,转动转轮,标本台上下运动并按调好的切片厚度向前推进一定的距离,组织块上下运动一次,便在刀片上得到一张合乎厚度要求的切片.
切片刀与切片的质量直接相关.切片前必须磨刀,方法是：将切片刀装上刀柄、刀背夹、滴少许石蜡油在平滑的磨刀石上,将刀贴着磨刀石以背向刀口方向磨,使用完毕后应及时用二甲苯将石蜡油擦净.
（3）切片方法
切片前,将刀口置放大镜下观察,选择刀口平整无缺刻的部分来进行切削.将所要切的包埋块固定在标本台上,使包埋块外切面与标本夹截面平行,并让包埋块稍露出一截.将刀台推至外缘后松开刀片夹的螺旋,上好刀片,使切片刀平面与组织切面间呈15°左右的夹角,包埋块上下边与刀口平行.在微动装置上调节切片要求的厚度,调节时应注意指针不可在两个刻度之间,否则容易损伤切片机,将刀台移至近标本台处,让刀口与组织切面稍稍接触,这时就可以开始切片了.方法是：右手转动转轮,左手持毛笔在刀口稍下端接隹切好的片子,并托住切下的蜡带,待蜡带形成一定长度后,右手停止转动,持另一枝毛笔轻轻将蜡带挑起,平放于衬有黑纸的纸盒内,注意切片速度不宜太快,摇动转轮用力应均匀,防止切片机震动厉害引起切片厚薄不均匀,还应注意转动的方向,以防标本台后移而切不到片子.切片完毕,应及时用氯仿将切片机的有关部分擦净.
（4）切片中存在的问题及补救方法
石蜡切片是很不容易掌握的,有时很容易成功,有时则由于某种因素而造成切片的质量低劣,甚至完全失败.现将切片时经常遇到的一些缺点、可能的原因以及补救办法列于表1-3.
表1-3 石蜡切片可能产生的问题和解决方法
缺 点：石蜡带弯曲不直
原 因：
1．石蜡块上下两边不平行
2．石蜡块的上下两边不和刀口平行
3．刀口锋利不一,局部产生差异
4．蜡块的一边较另一边为软,或两边的硬度不一致
5．材料未居蜡块正中央
6．材料大而形不正
补 救 办 法 ：
1．取下台木,将两边修干
2．调节标本台,使两者平行
3．移动刀片,改用新的刀口
4．待蜡块冷却后再切,或重新包埋
5．用刀片切去部分石蜡,使材料居中
6．在大的一边切去少许石蜡
缺 点：切片分离、不能连成带状
原 因：
1．室温过低
2．石蜡过硬
3．材料边缘留蜡太少
4．刀的角度不适合
补 救 办 法 ：
1．在切片机上方开一电灯或提高室温
2．在蜡块面加一层45℃的软蜡或用手指蜡摩擦块面
3．重新包埋
4．矫正刀的角度
缺 点：切片卷起呈圆筒状
原 因：
1．室温过低
2．石蜡过硬
3．刀口太钝
4．刀的倾角太大
补 救 办 法 ：
1．提高室温
2．加软蜡
3用毛笔将蜡片摊开压住,切2—3 片即成带
4．减小倾角
缺 点：切片粘附于切片刀,皱摺在一起
原 因：
1．室温过高
2．石蜡过软
3．刀口上留有一层石蜡
4．刀口钝
补 救 办 法 ：
1．降低室温
2．将蜡块投入凉水中稍浸耒—增加
3．切片厚度,改用硬蜡包埋,用二甲苯拭去刀口的石蜡
4．磨刀或移动刀口
缺 点：切片纵裂
原 因：
1．刀有缺口
2．石蜡块中含有颗粒、杂质
3．刀口留有碎屑或细丝
4．组织太硬
补 救 办 法 ：
1．可移动刀口
2．将颗粒拽去
3．清洁刀口
4．让包埋块在水中浸泡
缺 点：切片有横纹
原 因：
1．刀和台木的固定螺丝太松
2．刀口倾斜度太大
3．刀口有石蜡屑
补 救 办 法 ：
1．旋紧螺旋
2．可放平1—2.后再切
3．用氯仿拭去
缺 点：切片厚薄不匀
原 因：
1．切片机有毛病
2．夹刀不当
3,未旋紧标本台螺旋
4.石蜡块过硬
补 救 办 法 ：
1．矫正切片机装置
2．对症治疗
3．旋紧螺旋
4．将石蜡块在水中浸泡
缺 点：每张切片厚薄不匀
原 因：
1．刀口震动,是由于材料过硬
2．刀的倾角太大
补 救 办 法 ：
1.在蜡块表面涂一层火棉胶
2．减小倾角
缺 点：材料发生裂隙破碎或脱落
原 因：
1．脱水不干净
2．有透明剂残留
3．石蜡透入时,温度过高或时间过长
4．由于脱水剂和透明剂的影响,使组织变硬发脆
5．材料太硬或太粗
补 救 办 法 ：
1．无法弥补
2．增加浸蜡时间,重新包埋
3．无法补救
4．用正丁醇、叔丁醇和二氧六环等进行脱水和透明
5．在蜡块表面涂一薄层火棉胶溶液
缺 点：切片时发生沙沙声
原 因：
1．组织块过硬
2．包埋温度过高
3,材料内留有结晶体
补 救 办 法 ：
1．浸水中软化
2．无法补救
3．无法补救
缺 点：石蜡块将蜡带抬起
原 因：
1．由于摩擦而产生静电荷所致
2．石蜡块上面附有石蜡碎屑
3．刀口上附有石蜡碎屑
补 救 办 法 ：
1．提高室温
2．用刀片将碎屑清除
3．用二甲苯或氧仿清除
7．贴片
切好的切片必须贴附于载玻片上才能作进一步处理,但是切片常有细小的横纹,必须经展平后才能贴附,否则影响染色和观察.
贴片一般有捞片法和烫板法.
捞片法比较简单,首先将切片分割开,投入到48℃的温水浴中,这时切片都浮在水面上,由于表面张力的作用使切片自然展平,然后用涂有甘油蛋白溶液（将鸡蛋一个打破入杯中,去除蛋黄留下蛋白,用筷子充分调打成雪花状泡沫,然后用双层纱布过滤至容器中,加入等量的甘油,混合,最后加入百分之一体积的麝香草酚（thymol）作防腐用,可保存几个月到一年.）或5％明胶水溶液的载玻片倾斜着插入水面去捞取切片,使切片贴附在载玻片的合适位置,于室温下放置一昼夜后使其彻底干燥.
烫板法,是将涂有粘片剂的载玻片上涂上水,把已分割好的切片贴上去,再置载玻片于35℃恒定的烫板上让切片摊干,并倾斜或用吸水纸吸去水分,最后将载玻片再度放烫板上晾干.
要注意,不管是使用捞片法还是烫板法,所用的载玻片必须洁净,不能有油污（检验法：已涂有粘片剂的载玻片上滴加数滴蒸馏水,若发现水不均匀分散而聚成滴状,即表示载玻片不清洁,有残留油脂等物在上面）；切片的光面应朝下,否则染色过程中切片容易脱落.
8．染色
组织切片是无色透明的,必须进行染色后才能观察到各种微细结构.染色方法很多,但是染色剂往往是水溶液,因此切片必须经过脱蜡而再度复水.这方法即为脱水、透明的逆过程.由于切片十分菲薄,处理的时间大大减少,一般每级停留约2～5min.
染色是一个复杂的过程,兼有物理和化学作用,对其中的机制目前了解得不很清楚.研究细胞器和细胞内的重要组分都有很多现成的方法,例如显示DNA的Feulgen反应,显示RNA的Brachet反应,显示多糖的PAS反应,显示蛋白质的Millon反应和显示某些酶的钙—钴法等,可以根据不同的要求来选用.
9．透明
染色后的切片须再次经过脱水、透明.标本经二甲苯透明后,折射率改变,透明度提高,使得染上色的部位更清晰地显示出来.
10．封藏
封藏的目的是使制成的切片能够永久保存,封藏剂必须能与透明剂互溶,对染色无影响,折射率近似玻璃和具有粘性的物质,常用的封藏剂有加拿大树胶和中性树胶.
封片的方法是：将载玻片从二甲苯中吸出后,吸去多余的二甲苯,在标本上的二甲苯尚未干透之前加一滴树胶,仔细覆盖上盖玻片,避免产生气泡,也不得拖动盖玻片,以免将标本破坏.树胶量视盖玻片大小而定,勿使过多过少.
贴上标签,注明材料、染色法,待封藏剂凝固后便成为一张成功的石蜡切片.