如何从酵母得到较纯的RNA
来源：学生作业帮助网 编辑：六六作业网 时间：2024/11/17 16:30:12
如何从酵母得到较纯的RNA
如何从酵母得到较纯的RNA
如何从酵母得到较纯的RNA
一、目的
掌握从酵母中分离制备蛋白质和 RNA 的原理和方法,学习普通离心机的使用方法.
二、原理
酵母细胞富含蛋白质和核酸.用稀碱液（ 0.2% 的氢氧化钠）处理酵母使细胞裂解,离心收集上清液,得到酵母核蛋白抽提液.用盐酸调节抽提液 pH 至 3.0 （核蛋白的等电点）,核蛋白溶解度下降大量沉出,离心收集沉淀物为酵母蛋白质粗制品.
酵母核蛋白是一种结合蛋白质,是蛋白质与核酸的复合物.酵母核酸主要是 RNA （含量为干菌体的 2.67 ％ -10.0 ％）,DNA 含量较少,仅为 0.03 ％ -0.516 ％.如设法使酵母核蛋自中的蛋白质与核酸分离并除去蛋白质和 DNA ,就可得到较纯的 RNA 制品.这可通过以下操作完成：将核蛋自制品溶于含有 SDS 的缓冲液中,加等体积的水饱和酚,剧烈振荡后离心,溶液分成两层,上层为水相含有 RNA ,下层为酚相,变性蛋白及 DNA 存在于酚相及两相界面处.吸出水相并加乙醇即可沉淀出酵母 RNA .若用氯仿 - 异戊醇进一步处理 RNA 制品,可获得纯度更高的 RNA .
三、仪器、试剂和材料
1 .仪器
（ 1 ）离心机
（ 2 ）干燥箱
（ 3 ）恒温水浴
（ 4 ）真空千燥器
（ 5 ）天平
（ 6 ） 751 型分光光度计
（ 7 ）冰箱
（ 8 ）量筒（ 50ml ）
（ 9 ）蒸发皿
（ 10 ） Eppendorf 管（ 1.5 ml ）
（ 11 ）烧杯（ 50m1 ,100ml ）
2 .试剂（均为分析纯）
（ 1 ） 0 .2 ％ NaOH 溶液
（ 2 ） 6 mol/LHCl 溶液
（ 3 ） 95 ％乙醇
（ 4 ） SDS- 缓冲液：0.3% SDS ,0.1 mol/ L NaCl ,0.0 5 mol/ l 乙酸钠,用乙酸调到 pH5 .0
（ 5 ）饱和酚液：重蒸苯酚用 (4) 溶液饱和
（ 6 ）氯仿一异戊醇液：24 ：1(V/V)
（ 7 ）含 2% 乙酸钾的 95 ％乙醇溶液
（ 8 ）无水乙醇
（ 9 ）乙醚
3 .材料
鲜酵母或干酵母粉,pH0.5 一 5.0 的精密试纸.
四、操作步骤
1.酵母核蛋白的提取
称取鲜酵母 30g 或干酵母粉 5g,倒入 100ml 的烧杯中.加入 40ml 0.2%NaOH 溶液,在 20-40C 水浴上搅拌提取 30-60min 后 4000r/min 下离心 10min,取上清液于 50ml 的烧杯中,并置于放有冰块的 250ml 烧杯中冷却,待冷至 10 ℃以下时,用 6mol/ L HCl 小心地调节溶液的 pH 至 3.0 左右.随着 pH 下降,溶液中白色沉淀逐渐增加,到等电点时沉淀最多（注意严格控制 pH ）.pH 调好后继续于冰水中静置 l0min ,使沉淀充分,颗粒变大.将此悬浮液以 3000r/min 离心 20min ,倒掉上层清液.将沉淀物转入蒸发皿内,放入真空干燥器或干燥箱中干燥之后称重,这就是酵母核蛋白粗品.
2.苯酚法提取酵母 RNA
取上述核蛋白研碎,加 10ml SDS- 缓冲液使成匀浆,洗入各 Rppendorf 管（略少于管容积的一半）,室温静置 10min ,再加等体积的饱和酚液,室温下剧烈振荡 5min 后置冰浴中分层,4000r/min 离心 10min ,吸出上层清液,转入新的 Eppendorf 管,加 2 倍体积 95 ％乙醇（含 2 ％乙酸钾）,在冰浴中放置 30min ,使 RNA 沉淀.再以 10 000r/min 离心 5min ,弃上清液,沉淀用少许无水乙醇和乙醚各洗一次,迅速离心各 lmin ,保留沉淀.倾去乙醚后,减压真空干燥,准确称重,记录.