原核微生物的基因更组各类型及其原理、区别RT

原核微生物的基因更组各类型及其原理、区别RT
原核微生物的基因更组各类型及其原理、区别
RT

原核微生物的基因更组各类型及其原理、区别RT
http://221.204.254.28/resource/CZ/CZSW/Swts/WSWXJC/2159_SR.HTM
在原核微生物中,基因重组主要有转化、转导、接合和原生质体融合4种形式
（一）转化（transformation）
受体菌（recipient或receptor）直接吸收了来自供体菌（donor）的DNA片段,通过交换,把它整合到自己的基因组中,再经复制就使自己变成一个转化子（transformant）.这种受体菌接受供体菌的DNA片段而获得部分新的遗传性状的现象,就称转化或转化作用.脱氧核糖核酸酶可以抑制转化作用的进行.转化现象的发现,尤其是转化因子DNA本质的证实,是现代生物学发展史上的一个重要里程碑,由此,促进了分子生物学的建立和发展.
在原核生物中,转化是一个较普遍的现象,在Streptococcuspneumoniae（肺炎链球菌）、Haemophilus（嗜血杆菌属）、Bacillus（芽孢杆菌属）、Neisseria（奈瑟氏球菌属）、Rhizobium（根瘤菌属）、Staphylococcus（葡萄球菌属）、Pseudomonas（假单胞菌属）和Xanthomonas（黄单胞菌属）尤为多见.在若干放线菌和蓝细菌以及少数真核微生物如Saccharomycescerevisiae（酿酒酵母）、Neu-rosporacrassa（粗糙脉孢菌）和Aspergillusniger（黑曲霉）中,也有转化的报道.在细菌中,肠杆菌科的一些菌种很难进行转化,其主要原因,一方面由于外来DNA难以掺入到细胞中,另一方面还由于在受体细胞内常存在可降解线形DNA的核酸酶.如果用CaCl2处理E．coli的球状体,就可以使之发生低频率的转化.另外,已有若干利用霉菌的原生质体进行转化的报道.
两个菌种或菌株间能否发生转化,与它们在进化过程中的亲缘关系有着密切的联系.但即使在转化率极高的那些种中,其不同菌株间也不一定都可发生转化.研究发现,能进行转化的受体细胞必须处于感受态（competence）,亦即受体细胞最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态.
例如,Streptococcuspneumoniae的感受态出现在生长曲线中的指数期后期,而Bacillus的一些菌种则往往出现在指数期末及稳定期.在外界环境因子中,环腺苷酸（cAMP）及Ca2+等的影响最为明显.有人发现,cAMP可使嗜血杆菌细胞群体的感受态水平提高一万倍.处于感受态高峰时,群体中呈感受态的细胞数也随菌种的不同而不同,如Bacillussubtilis不超过10～15％,而Streptococcuspneumoniae和Haemophilusinfluenzae（流感嗜血杆菌）则达100％.实现转化所需的DNA浓度是极低的,例如,在群体中含有15％感受态细胞的情况下,每毫升细胞悬液只要有0.1μgDNA即可有效地发生转化.
已知感受态因子是一种胞外蛋白,有人已把它从Streptococcus和Bacillus中分离出来了.它的分子量为5000～10000Da.据推测,这种蛋白质可能是细胞膜上的一种组成,它可以催化外来DNA片段的吸收或降解细胞表面某种成分,以让细胞表面的DNA受体显露出来；也可能是一种自溶酶.对不同的细菌而言,其每个细胞上可与DNA结合的位点数是不同的.有人计算,在H.influenzae上有4～10个,而在S.pneumoniae上则有30～80个.由S.pneumoniae所产生的感受态因子,可使同菌株的非感受态细胞变成感受态的,而Bacillussubtilis（枯草杆菌）的感受态因子则没有这种作用.
在本章第一节中已介绍过,转化因子的本质是DNA（包括高度提纯的或存在于微生物自溶物中的）.一般认为经过多次抽提操作后,每一转化DNA片段的分子量都小于1×107,即约占细菌核染色体组的0.3％,在其上平均约含15个基因.而粗制的DNA则分子量较大.每个感受态细胞约可掺入10个转化因子.转化的频率往往是很低的,一般只有0.1～1％,最高时亦只达10％左右.据研究,呈质粒形式（双链,共价闭合环状DNA）的转化因子,其转化频率最高,因为它进入受体菌中后,可不必同受体染色体进行交换、整合即可进行复制和表达（“流产”性的转化例外）；一般的转化因子都是线状双链DNA；也有少数报道认为线状单链DNA也有转化作用.
转化的具体过程以革兰氏阳性菌S.pneumoniae研究得最多,主要过程可见图8-25.
从图8-25中可以看到转化过程可分以下几个阶段：①双链DNA片段与感受态受体菌细胞表面的特定位点（主要在新形成细胞壁的赤道区）结合,此时,一种细胞膜的磷脂成分——胆碱可促进这一过程.在吸附过程的前阶段,如外界加入DNA酶,就会减少转化子的产生.稍后,DNA酶即无影响,说明此时该转化因子已进入细胞；②在吸附位点上的DNA被核酸内切酶分解,形成平均分子量为4～5×106的DNA片段；③DNA双链中的一条单链被膜上的另一种核酸酶切除,另一条单链逐步进入细胞,这是一个耗能过程.分子量小于5×105的DNA片段不能进入细胞.这时如用低浓度溶菌酶处理,因它提高了细胞壁的通透性,故可提高转化频率；④来自供体的单链DNA片段在细胞内与受体细胞核染色体组上的同源区段配对,接着受体染色体组上的相应单链片段被切除,并被外来的单链DNA交换、整合和取代,于是形成了一个杂合DNA区段（heterozygousregion）（图8-26）.在这一过程中,有核酸酶、DNA聚合酶和DNA连接酶的参与；⑤受体菌的染色体组进行复制,杂合区段分离成两个,其中之一获得了供体菌的转化基因（strr,链霉素抗性基因）,另一个未获strr基；⑥当细胞发生分裂后,一个子细胞含strr基因,这就是转化子；另一细胞与原始受体菌一样,仍是链霉素敏感型（Strs）.
用革兰氏阳性菌H.influenzae所得到的实验结果与上述情况基本相同,但有两个明显的差别：①它不像S.pneumoniae那样,能吸收非同源的DNA（如小牛胸腺DNA）,而只能吸收其同源DNA；②外来DNA片段仍以双链形式进入受体菌内,它的单链化是与整合过程同时发生的.
如果把噬菌体或其他病毒的DNA（或RNA）抽提出来,让它去感染感受态的宿主细胞,并进而产生正常的噬菌体或病毒后代,这种现象称为转染（transfection）.它与转化不同之处是病毒或噬菌体并非遗传基因的供体菌,中间也不发生任何遗传因子的交换或整合,最后也不产生具有杂种性质的转化子.
（二）转导（transduction）
通过完全缺陷或部分缺陷噬菌体的媒介,把供体细胞的DNA小片段携带到受体细胞中,通过交换与整合,从而使后者获得前者部分遗传性状的现象,称为转导.获得新遗传性状的受体细胞,就称转导子（transductant）.
转导现象是由J．Lederberg等（1952）在Salmonellatyphimurium（鼠伤寒沙门氏菌）中发现的.以后在许多原核生物中都陆续发现,例如在E．coli、Bacillus、Proteus（变形杆菌属）、Pseudomonas（假单胞菌属）、Shigella（志贺氏菌属）、Staphylococcus（葡萄球菌属）、Vibrio（弧菌属）和Rhizobium（根瘤菌属）中等.
转导现象在自然界中比较普遍,它在低等生物的进化过程中,很可能是一种产生新基因组合的重要方式.
目前所知道的转导已有多种,现分别介绍如下.
1．普遍转导（generalizedtransduction） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何DNA小片段的“误包”,而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象,称为普遍转导.普遍转导又可分为以下两种.
完全普遍转导 简称完全转导（completetransduction）.在S．typhimurium的完全普遍转导实验中,曾以其野生型菌株作供体菌,营养缺陷型突变株作受体菌,P22噬菌体作为转导媒介.当P22在供体菌内增殖时,宿主的核染色体组断裂,待噬菌体成熟与包装之际,极少数（10-6～10-8）噬菌体的衣壳将与噬菌体头部DNA芯子相仿的一小段供体菌DNA片段（在P22情况下,约为供体菌核染色体组的1％）误包入其中,因此,形成了一个完全不含噬菌体自身DNA的假噬菌体——完全缺陷噬菌体.当供体菌裂解时,如把少量裂解物与大量的受体菌群体相混,使其感染复数（m．o．i）小于1,这种完全缺陷噬菌体就可将这一外源DNA片段导入受体细胞内.在这种情况下,由于一个受体细胞只感染了一个完全缺陷噬菌体,故受体细胞不会发生往常的溶原化,也不显示其免疫性,更不会裂解和产生正常的噬菌体；还由于导入的外源DNA片段可与受体细胞核染色体组上的同源区段配对,再通过双交换而整合到受体菌染色体组上,所以使后者成为一个遗传性状稳定的转导子（图8-27和8-28）.于是就实现了完全普遍转导.
除S.typhimurium的P22噬菌体外,E.coli的P1噬菌体和Bacillussubtilis的PBS1和SP10等噬菌体都能进行完全转导.
（2）流产普遍转导 简称流产转导（abortivetransduction）.经转导而获得了供体菌DNA片段的受体菌,如果外源DNA在其内既不进行交换、整合和复制,也不迅速消失,而仅进行转录、转译和性状表达,这种现象就称流产转导.发生流产转导的细胞在其进行分裂后,只能将这段外源DNA分配给一个子细胞,而另一子细胞仅获得供体基因经转录、转译而形成的少量产物——酶,因此在表型上仍可出现轻微的供体菌特征,每经过一次分裂,就受到一次“稀释”.所以,能在选择性培养基平板上形成微小菌落就成了流产转导子的特点.流产转导的示意图见图8-29.
2．局限转导（restricted或specializedtransduction） 局限转导最初于1954年在E．coliK12中发现.指通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中,并获得表达的转导现象.它有这样几个特点：①只能转导供体菌的个别特定基因（一般为噬菌体整合位点两侧的基因）；②该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带；③缺陷噬菌体是由于其在形成过程中所发生的低频率（可形成10-5左右）“误切”,或由于双重溶源菌的裂解而形成,在后一情况下可形成50％缺陷噬菌体.E.coliK12的λ噬菌体可进行局限转导.根据转导频率的高低可把局限转导分成两类：
（1）低频转导（LFT,lowfrequencytransduction） 已知当温和噬菌体感染受体菌后,其染色体会开环,并以线状形式整合到宿主染色体的特定位点上,从而使宿主细胞发生溶源化,并获得对相同温和噬菌体的免疫性.如果该溶源菌因诱导而发生裂解时,就有极其少数（～10-5）的前噬菌体（prophage）发生不正常切离（abnormalexcesion）,其结果会将插入位点两侧之一的少数宿主基因（如E．coliλ前噬菌体的两侧分别为发酵半乳糖的gal基因或合成生物素的bio基因）连接到噬菌体DNA上（而噬菌体也将相应的一段DNA遗留在宿主的染色体组上）,通过衣壳的“误包”,就形成了一种特殊的噬菌体——缺陷噬菌体（defectivephage）（图8-30）.在E．coliK12中,可形成λdga1或λdg（带有供体菌gal基因的λ缺陷噬菌体,其中的“d”表示缺陷）或λdbio（带有供体菌bio基因的λ缺陷噬菌体）,它们没有正常λ噬菌体所具有的使宿主发生溶源化的能力.当它感染宿主细胞并整合在宿主的核基因组上时,可使宿主细胞成为一个局限转导子（即获得了供体菌的gal或bio基因）,而不是一个溶源菌,因而对λ噬菌体不具有免疫性.
由于宿主染色体上进行不正常切离的频率极低,因此在裂解物中所含的部分缺陷噬菌体的比例是极低（10-4～10-6）的,这种裂解物称LFT（低频转导）裂解物.LTF裂解物在低m．o．i（感染复数）情况下感染宿主,就可获得极少量的局限转导子,这就是低频转导.
（2）高频转导（HFT,highfrequencytrans-duction）当E．coligal-（不发酵半乳糖的营养缺陷型）这种受体菌用高m．o．i的LFT裂解物进行感染时,则凡感染有λdga1噬菌体的任一细胞,几乎同时都感染有正常的λ噬菌体.这时,λ与λdga1两者同时整合在一个受体菌的核染色体组上,从而使它成为一个双重溶源菌（doublelysogen）.当双重溶源菌被紫外线等诱导时,其中的正常λ噬菌体的基因可补偿λdga1所缺失的部分基因功能,因而两种噬菌体就同时获得复制的机会.所以,在双重溶源菌中的正常λ噬菌体被称为助体（或辅助）噬菌体（helperphage）.根据以上的特点可以知道,由双重溶源菌所产生的裂解物中,含有等量的λ和λdga1粒子,这就称HFT（高频转导）裂解物.如果用低m．o．i的HFT裂解物去感染另一个E．coligal-受体菌（不能发酵半乳糖的受体菌）的话,则可高频率地把它转化为能发酵半乳糖的E．coligal+转导子.这种方式的转导,就称高频转导.
3．溶源转变（lysogenicconversion） 这是一种表面上与转导相似但本质上却不同的特殊现象.当温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时,因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上,而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象,称为溶源转变.当宿主丧失这一噬菌体时,通过溶源转变而获得的新性状也就同时消失.由此可以看出,溶源转变与转导有着本质的不同.首先,这种温和噬菌体并不携带任何来自供体菌的外源基因,使宿主带来新性状的正是噬菌体本身的基因；其次,这种温和噬菌体是完整的,而不是缺陷的；第三,获得新性状的是溶源化的宿主细胞,而不是什么转导子；第四,获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失.
溶源转变的典型例子是Corynebacteriumdiphtheriae（白喉棒杆菌）不产白喉毒素的菌株,它在被β温和噬菌体感染而发生溶源化时,就会变成产毒的致病菌株.Clostridiumbotulinum（肉毒梭菌）经其特定温和噬菌体感染而成为溶源菌时,就会产生C型或D型肉毒毒素.Salmonellaanatum（鸭沙门氏杆菌）在用E15噬菌体感染而成为溶源菌时,细胞表面的多糖结构会发生相应的变化.不久前,国内也有人发现,在Streptomyceserythreus（红霉素链霉菌）中,其P4温和噬菌体也有溶源转变活性,由它决定了宿主的红霉素生物合成和形成气生菌丝的能力.
（三）接合（conjugation）
供体菌（“雄”）通过其性菌毛与受体菌（“雌”）相接触,前者传递不同长度的单链DNA给后者,并在后者细胞中进行双链化或进一步与核染色体发生交换、整合,从而使后者获得供体菌的遗传性状的现象,称为接合.通过接合而获得新性状的受体细胞,就是接合子（conju-gant）.
由于在细菌和放线菌等原核生物中出现基因重组的机会极为稀少（如E．coliK12约为10-6）,而且由于较难找到重组子（re-combinant）的形态指标,所以有关细菌接合的研究直至J．Lederberg等（1946）采用E．coli的两株营养缺陷型进行实验后,才奠定了方法学上的坚实基础,这一技术也为以后开展一系列其他微生物遗传学问题的研究创造了必要的条件.这一方法的基本原理见图8-31.
在细菌和放线菌中都存在着接合现象.在细菌中,尤以革兰氏阴性细菌如E．coli以及Salmonella（沙门氏菌属）、Shigella（志贺氏菌属）、Serratia（沙雷氏菌属）、Vibrio（弧菌属）、Azotobacter（固氮菌属）、Klebsiella（克雷伯氏菌属）和Pseudomonas（假单胞菌属）等生活在动物肠道内的一些种最为常见.在放线菌中,研究得最多的是Streptomyces（链霉菌属）和Nocardia（诺卡氏菌属）,尤以Streptococcuscoelicolor（天蓝色链霉菌）研究得最为详细.此外,接合还可发生在不同属的一些种间,如E．coli与Salmonellatyphimurium（鼠伤寒沙门氏菌）间或S．typhimurium与Shigelladysenteriae（痢疾志贺氏菌）间.
在细菌中,接合现象研究得最清楚的是E．coli.根据对接合行为的研究,发现E．coli是有性别分化的.决定其性别的是一种质粒,即F因子.F因子是一种属于附加体（episome）的质粒,亦即它既可脱离核染色体组而在细胞质内游离存在,也可插入即整合在染色体组上；它既可经过接合作用而获得,也可通过吖啶类化合物、溴化乙锭或丝裂霉素C等的处理,使其DNA的复制受抑制后而从细胞中消除；它是有关细菌性别的决定者,凡有F因子的细胞,在其表面就有相应的性菌毛存在.有关F因子的其他内容,还可参阅本章第一节的阐述.
根据细胞中是否存在F因子以及其存在方式的不同,可把E．coli分成以下四种相互有联系的接合型的菌株（图8-32）.
（1）F+（“雄性”）菌株在F+菌株的细胞中,存在着游离的F因子（1～4个）,在细胞表面还有与F因子数目相当的性菌毛.当F+菌株与F-菌株相接触时,前者可通过性菌毛而将F因子转移到后者细胞内,因而使Fˉ菌株也转变成F+菌株（一般可达到100％）.F因子的传递过程为：①F因子的一条DNA单链在特定的位点上发生断裂；②断裂后的单链逐步解开,同时以另一条留存的环状单链作模板,通过模板的滚动,一方面把上述解开的单链以5′-端为先导可能通过性菌毛而推入到F-细胞中,另一方面,又在供体细胞内,以滚动的环状DNA单链作模板,重新合成一条互补的环状单链,以取代已解开并传递至F-中的那条单链,这一DNA复制机制即称“滚环模型”（rollingcirclemodel）；③在F-细胞中,在这条外来的供体DNA线状单链上也合成了一条互补的新DNA单链,并随之恢复成一个环状的双链F因子,因此,F-菌株变成了F+菌株（而原来的供体菌F+菌株仍为F+菌株）.
（2）F-（“雌性”）菌株在F-菌株中不含F因子,细胞表面也没有性菌毛.但它可通过与F+菌株或F′菌株的接合而接受供体菌的F因子或F′因子,从而使自己转变成“雄性”菌株,也可接受来自Hfr菌株的一部分或全部遗传信息.如果是后一种情况,则它在获得一系列Hfr菌株的遗传性状的同时,还同时获得了处于转移染色体末端的F因子,从而使自己也从原来的“雌性”菌株转变成“雄性”菌株.有人统计,从自然界分离到的2000个E．coli菌株中,约有30％的菌株是F-.
（3）Hft（高频重组,highfrequencyrecombination）菌株因为Hfr菌株与Fˉ菌株接合后发生重组的频率要比F+与F-接合后的重组频率高出数百倍,故名.在Hfr细胞中,其F因子已从游离状态转变成在核染色体组特定位点上的整合状态（产生频率约10-5）.当Hfr与F-菌株发生接合时,Hfr的染色体双链中的一条单链在F因子处发生断裂,由环状变为线状,F因子则位于线状单链DNA之末端.整段线状染色体（单链）也以5′-末端引导,等速地转移至F-细胞.在没有外界干扰的情况下,这一转移过程的全部完成约需100分钟.实际上在转移过程中,使接合中断的因子很多,因此,这么长的线状单链DNA常常在转移过程中发生断裂.所以,越是处于Hfr染色体前端的基因,进入F-的几率就越高,这类性状出现在接合子中的时间就越早,反之亦然.由于F因子位于线状DNA的末端,进入F-细胞的机会最少,故引起F-变成F+（性别转变）的可能性也最小.因此,Hfr与F-接合的结果其重组频率虽最高,但转性频率却最低.
Hfr菌株的染色体转移与上述的F+菌株的F因子转移过程基本相同,都是按滚环模型来进行的.所不同的是,进入F-菌株的单链染色体片段经双链化后,形成部分合子（merozygote,即半合子）,然后两种染色体的同源区段进行配对,再经过双交换后,就发生遗传重组（图8-33）.
根据图8-33可以将Hfr与F-菌株间的接合中断试验分成几个过程,即①Hfr与F-菌株细胞配对；②形成接合管,即通过性菌毛使两个细胞相连.Hfr的染色体在起始子（i）部位开始复制,至F因子插入的部位才告结束.供体DNA的一条单链通过性菌毛进入受体细胞；③发生接合中断,使F-成为一个部分双倍体,在那里,供体的单链DNA片段合成了另一条互补的DNA链；④外源双链DNA片段与受体菌的染色体DNA双链间进行双交换,从而产生了稳定的接合子.
由于上述DNA转移过程存在着严格的顺序性,所以,在实验室中可以每隔一定时间利用强烈搅拌（例如用组织捣碎器或杂交中断器）等措施,使接合细胞对中断其接合,以获得呈现不同数量Hfr性状的F-接合子.根据这一原理,就可选用几种有特定整合位点的Hfr菌株,使其与Fˉ菌株进行接合,并在不同时间使接合中断,最后根据F-中出现Hfr菌株中各种性状的时间早晚（用分钟表示）,画出一幅比较完整的环状染色体图（chromosomemap）.这就是由Wollman和Jacob（1955）首创的接合中断法（interruptedmatingexperiment）的基本原理.同时,原核微生物染色体的环状特性也是从这里开始认识的（图8-34）.据报道,至1983年,在E．coli染色体上已定位的基因数已多达1027个.
（4）F′菌株 当Hft菌株内的F因子因不正常切离而脱离核染色体组时,可重新形成游离的但携带一小段染色体基因的特殊F因子,称F′因子.携带了F′因子的菌株,其遗传性状介于F+与Hfr菌株之间,这就是初生F′菌株（primaryF′-strain）.通过F′菌株与Fˉ菌株间的接合,就可以使后者亦转变成F′菌株,这就是次生F′菌株（secondaryF′-strain）,它既获得了F因子,同时又获得了来自初生F′菌株的若干新的遗传性状（图8-35）,所以,次生F′细胞是一个部分双倍体.以这种接合来传递供体基因的方式,称为F因子转导（F-duction）、性导（sexduction）或F因子媒介的转导（F-mediatedtransduction）.
（四）原生质体融合（protoplastfusion）
通过人为的方法,使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合,并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的、遗传性稳定的融合子（fusant）的过程,称为原生质体融合.原核生物的原生质体融合研究是在70年代后期才发展起来的一种育种新技术,这是继转化、转导和接合之后一种更有效的转移遗传物质的手段.
能进行原生质体融合的细胞是极其广泛的,不仅包括原核生物中的细菌和放线菌,而且还包括各种真核生物的细胞,例如属于真核微生物的酵母菌和霉菌以及高等动植物和人体的不同细胞.
原生质体融合的主要步骤是：先选择两个有特殊价值的并带有选择性遗传标记的细胞作为亲本,在高渗溶液中,用适当的脱壁酶（如细菌或放线菌可用溶菌酶或青霉素处理,真菌可用蜗牛酶或其他相应的脱壁酶等）去除细胞壁,再将形成的原生质体（实际上往往是些脱壁不完全的球状体）进行离心聚集,并加入促融合剂PEG（聚乙二醇polyethyleneglycol）或通过电脉冲等促进融合,然后在高渗溶液中稀释,再涂在能使其再生细胞壁和进行分裂的培养基上.待形成菌落后,通过影印接种法,将其接种到各种选择性培养基上,鉴定它们是否为融合子,最后再测定其他生物学性状或生产性能（图8-36）.