直接法提取DNA的步骤?我知道是细胞裂解、核酸提取、核酸纯化抱歉 我没说清楚 我指的是土壤DNA的提取~不是真核细胞~
来源：学生作业帮助网 编辑：六六作业网 时间：2024/12/23 17:11:17
直接法提取DNA的步骤?我知道是细胞裂解、核酸提取、核酸纯化抱歉 我没说清楚 我指的是土壤DNA的提取~不是真核细胞~
直接法提取DNA的步骤?
我知道是细胞裂解、核酸提取、核酸纯化
抱歉 我没说清楚 我指的是土壤DNA的提取~不是真核细胞~
直接法提取DNA的步骤?我知道是细胞裂解、核酸提取、核酸纯化抱歉 我没说清楚 我指的是土壤DNA的提取~不是真核细胞~
土壤DNA?土壤有DNA?土壤微生物?一样的,用土壤浸出液,照一样的流程
一般真核细胞基因组DNA有107-9bp,可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取,常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞,随后用酚抽提而实现的.这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析,还可用于PCR的模板、文库构建等实验.2 I+ P7 Y!x d/ {3 {
根据材料来源不同,采取不同的材料处理方法,而后的DNA提取方法大体类似,但都应考虑以下两个原则：
1、 防止和抑制DNase对DNA的降解.
2、 尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏.
试剂准备：
1、 TE:10mM Tris-HCl (pH 7.8); 1mM EDTA (pH 8.0).
2、 TBS:25mM Tris-HCl (pH 7.4); 200mM NaCl; 5mM KCl." `4 {1 T( G" f+ D9 @0 9 g) e7 y; O
3、 裂解缓冲液：250mM SDS; 使用前加入蛋白酶K至100mg/ml.& Z1 H,h:o( P7 D
4、 20% SDS 6 k8 i) @+ N5 W- V$ v; y# }2 x
5、 2mg/ml蛋白酶K 2 S9 f$ `) m/ ^4 C
6、 Tris饱和酚（pH 8.0）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿
7、 无水乙醇、75%乙醇
试验步骤：!y) e% f( A; r; j+ j
材料处理：
1、 新鲜或冰冻组织处理：/ $ \+ @) v2 h; a6 G% \ w' K
1) 取组织块0.3-0.5cm3,剪碎,加TE 0.5ml,转移到匀浆器中匀浆..R% A.y5 z- N
2) 将匀浆液转移到1.5ml离心管中." F; k$ S4 J9 _' q+ Y2
3) 加20% SDS 25 ml,蛋白酶K (2mg/ml) 25 ml,混匀.& ^% [8 p!u,H/ x U# `% V( I
4) 60°C水浴1-3hr.
2、 培养细胞处理：
1) 将培养细胞悬浮后,用TBS洗涤一次.0 s* r) c:v1 E
2) 离心4000g×5min,去除上清液.# p3 J.U,l.b7 v!_
3) 加10倍体积的裂解缓冲液.2 W4 L% h/ G4 P2 m6 K
4) 50-55°C水浴1-2hr.
DNA提取：
1、 加等体积饱和酚至上述样品处理液中,温和、充分混匀3min.3 ^( k# l,z.E!f5 n% H.a
2、 离心5000g×10min,取上层水相到另一1.5ml离心管中.; _4 u w2 t9 K) f; C) ]!a
3、 加等体积饱和酚,混匀,离心5000g×10min,取上层水相到另一管中.
4、 加等体积酚/氯仿,轻轻混匀,离心5000g×10min,取上层水相到另一管中.如水相仍不澄清,可重复此步骤数次.# u- t0 }.d5 J" z5 y# o
5、 加等体积氯仿,轻轻混匀,离心5000g×10min,取上层水相到另一管中.% q/ 3 f,U8 t9 b
6、 加1/10体积的3M醋酸钠（pH 5.2）和2.5倍体积的无水乙醇,轻轻倒置混匀.
7、 待絮状物出现后,离心5000g×5min,弃上清液.
8、 沉淀用75%乙醇洗涤,离心5000g×3min ,弃上清液.
9、 室温下挥发乙醇,待沉淀将近透明后加50-100ml TE溶解过夜