MS培养基的配制与灭菌

MS培养基的配制与灭菌
MS培养基的配制与灭菌

MS培养基的配制与灭菌
植物组织培养中常用的一种培养基是MS培养基.MS培养基的配制包括以下步骤.
培养基母液的配制和保存 MS培养基含有近30种营养成分,为了避免每次配制培养基都要对这几十种成分进行称量,可将培养基中的各种成分,按原量的20倍或200倍分别称量,配成浓缩液,这种浓缩液叫做培养基母液.这样每次使用时,取其总量的1/20(50 mL)或1/200(5 mL),加水稀释,制成培养液.现将制备培养基母液所需的各类物质的量列出,供配制时使用.
大量元素(母液Ⅰ) mg／L
NH4NO3 33 000
KNO3 38 000
CaCl2·2H2O 8 800
MgSO4·7H2O 7 400
KH2PO4 3 400
微量元素(母液Ⅱ)
KI 166
H3BO3 1 240
MnSO4·4H2O 4 460
ZnSO4·7H2O 1 720
Na2MoO4·2H2O 50
CuSO4·5H2O 5
CoCl2·6H2O 5
铁盐(母液Ⅲ)
FeSO4·7H2O 5 560
Na2-EDTA·2H2O 7 460
有机成分(母液Ⅳ)
ⅣA
肌醇 20 000
ⅣB
烟酸 100
盐酸吡哆醇(维生素B6) 100
盐酸硫胺素(维生素B1) 100
甘氨酸 400
以上各种营养成分的用量,除了母液Ⅰ为20倍浓缩液外,其余的均为200倍浓缩液.
上述几种母液都要单独配成1 L的贮备液.其中,母液Ⅰ、母液Ⅱ及母液Ⅳ的配制方法是：每种母液中的几种成分称量完毕后,分别用少量的蒸馏水彻底溶解,然后再将它们混溶,最后定容到1 L.
母液Ⅲ的配制方法是：将称好的FeSO4·7H2O和Na2-EDTA·2H2O分别放到450 mL蒸馏水中,边加热边不断搅拌使它们溶解,然后将两种溶液混合,并将pH调至5?5,最后定容到1 L,保存在棕色玻璃瓶中.
各种母液配完后,分别用玻璃瓶贮存,并且贴上标签,注明母液号、配制倍数、日期等,保存在冰箱的冷藏室中.
MS培养基中还需要加入2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、萘乙酸(NAA)、6?苄基嘌呤(6BA)等植物生长调节物质,并且分别配成母液(0?1 mg/mL).其配制方法是：分别称取这3种物质各10 mg,将2,4-D和NAA用少量(1 mL)无水乙醇预溶,将6BA用少量(1 mL)的物质的量浓度为0.1 mol/L的NaOH溶液溶解,溶解过程需要水浴加热,最后分别定容至100 mL,即得质量浓度为0?1 mg/mL的母液.
配制培养液 用量筒或移液管从各种母液中分别取出所需的用量：母液Ⅰ为50 mL,母液Ⅱ、Ⅲ、ⅣA和ⅣB各5 mL.再取2,D 5 mL、NAA 1 mL,与各种母液一起放入烧杯中.
配制培养液时应注意：①在使用提前配制的母液时,应在量取各种母液之前,轻轻摇动盛放母液的瓶子,如果发现瓶中有沉淀、悬浮物或被微生物污染,应立即淘汰这种母液,重新进行配制；②用量筒或移液管量取培养基母液之前,必须用所量取的母液将量筒或移液管润洗2次；③量取母液时,最好将各种母液按将要量取的顺序写在纸上,量取1种,划掉1种,以免出错.
溶化琼脂 用粗天平分别称取琼脂9 g、蒸糖30 g,放入1 000 mL的搪瓷量杯中,再加入蒸馏水750 mL,用电炉加热,边加热边用玻璃棒搅拌,直到液体呈半透明状.然后再将配好的混合培养液加入到煮沸的琼脂中,最后加蒸馏水定容至1 000 mL,搅拌均匀.
需要注意的是,在加热琼脂、制备培养基的过程中,操作者千万不能离开,否则沸腾的琼脂外溢,就需要重新称量、制备.此外,如果没有搪瓷量杯,可用大烧杯代替.但要注意大烧杯底的外表面不能沾水,否则加热时烧杯容易炸裂,使溶液外溢,造成烫伤.
调pH 用滴管吸取物质的量浓度为1 mol/L的NaOH溶液,逐滴滴入溶化的培养基中,边滴边搅拌,并随时用精密的pH试纸(5?0)测培养基的pH,一直到培养基的pH为5?8为止(培养基的pH必须严格控制在5?8).
培养基的分装 溶化的培养基应该趁热分装.分装时,先将培养基倒入烧杯中,然后将烧杯中的培养基倒入锥形瓶(50 mL或100 mL)中.注意不要让培养基沾到瓶口和瓶壁上.锥形瓶中培养基的量约为锥形瓶容量的1/5～1/4.每1 000 mL培养基,可分装25～30瓶.
培养基分装完毕后,应及时封盖瓶口.用2块硫酸纸(每块大小约为9 cm×9 cm)中间夹1层薄牛皮纸封盖瓶口,并用线绳捆扎.最后在锥形瓶外壁贴上标签.
高压灭菌 培养基的高压灭菌包括以下几个步骤.
第一,码放锥形瓶.将装有培养基的锥形瓶直立于金属小筐中,再放入高压蒸气灭菌锅内.如果没有金属小筐,可以在两层锥形瓶之间放一块玻璃板隔开.
第二,放置其他需要灭菌的物品.将其他需要灭菌的物品也放入高压蒸气灭菌锅内,如装有蒸馏水的锥形瓶、带螺口盖的玻璃瓶、烧杯、广口瓶(以上物品都要用牛皮纸封口),用牛皮纸包裹的培养皿、剪刀、解剖刀、镊子、滤纸、铅笔等.
第三,灭菌.待需要灭菌的物品码放完毕,盖上锅盖.在98 kPa、121.3 ℃下,灭菌20 min.
灭菌后取出锥形瓶,让其中的培养基自然冷却凝固.最好放置1 d后再使用.