目的基因分离最常用的方法及原理?急
来源：学生作业帮助网 编辑：六六作业网 时间：2024/11/15 07:39:46
目的基因分离最常用的方法及原理?急
目的基因分离最常用的方法及原理?急
目的基因分离最常用的方法及原理?急
1.从生物基因组群体中分离目的基因
原核生物基因组较小,基因容易定位,用限制性内切酶将基因组切成若干段后,用带有标记的核酸探针,从中选出目的基因.真核生物一般通过基因组文库的方法获得目的基因.
图10-3-1 限制性内切酶
限制性内切酶(restrictive enzyme)是20世纪60年代末在细菌中发现的,能水解DNA分子骨架的磷酸二酯键,使一个完整的DNA分子切成若干段,每一种限制酶,都有自己特定的作用位点,而且切口或切下来的序列,往往是回文结构（palindromes）.例如Eco RI把GAATTC在GA之间切开,形成粘性末端.也有一些限制酶作用的结果产生不含粘性末端的平整末端,如HapI.多在原核生物中存在,能识别4～6个特苷酸特定的碱基序列.限制酶对细菌有保护作用,某些入侵的噬菌体可因DNA链被限制性酶切断而不能在细菌中繁殖,“限制”因此而得名.限制酶不能切开细菌本身的DNA,这是因为细菌DNA的腺嘌呤和胞嘧啶甲基化（-CH3）而受到保护之故.
这样就可以用限制性内切酶把一个基因组DNA分成很多片段,对于原核生物比较小的基因组来说,可以直接用标记地探针来获取在通过特定的方法,对于比较大的基因组,可以先制作基因文库,然后钓取所需要的带有目的基因的片段.
2.人工合成目的基因DNA片段
人工合成目的基因DNA片段有化学合成和酶促合成法两条途径.一般是采用DNA合成仪来合成长度不是很大的DNA片段.
3.PCR反应合成DNA
聚合酶链式反应（PCR)是以DNA变性、复制的某些特性为原理设计的.通过PCR技术获取所需要的特异DNA片段在实际应用用得非常多,但是前提条件是必须对目的基因有一定的了解,需要设计引物.PCR技术的原理如下：
图10-3-2 PCR原理图
（1）以混合的 DNA 片段作模板,例如,可以用 cDNA 基因文库做模板,在 90℃ 高温下,作为模板的双链 DNA 均变性,分开成为单链DNA.
（2）在反应体系中以有两种合成的 DNA 小段寡聚核苷酸做引物,这两种寡核苷酸应可以分别和特异 DNA 片段的正链的 3'末端与负链的 3'末端相结合.寡核苷酸引物要在 50℃ 的温度下,才能较好的找到可以配对的正链和负链,形成互补结合.显然,在混合 DNA 片段作模板的情况下,只有可以形成配对关系的 DNA 链才可特异性地结合引物寡核苷酸.这个过程又称为淬火.
（3）反应体系中还有高温 DNA 聚合酶,以及作为原材料的四种脱氧核苷三磷酸（4 X dNTP) .高温 DNA 聚合酶来自一种特殊的耐高温细菌,俗称 Taq 酶.在 70℃ 高温下,经 Taq 酶催化,以四种脱氧核苷三磷酸为原料,在形成互补的引物寡核苷酸后,迅速合成一条与模板 DNA 单链（正链或负链）互补结合的DNA新链.
（4）以上三个步骤周而复始,即反应体系的温度从 90oC- 50oC- 75oC,反应体系中经历：变性（ DNA 双链变性生成单链）——淬火（寡核酸引物和特异的 DNA 模板结合,配对）——合成（以引物为起点,合成与模板互补的 DNA 新链）.每次循环约需6-10分钟.经过20次循环,能与引物特异结合的那段 DNA ——即需要放大增殖目的 DNA 分子,可以扩增106倍.
4.mRNA差异显示法获得目的基因
mRNA差异显示(mRNA differential display,DD)是1992年由哈佛医学院Peng Liang等人建立的.原理是先用PCR技术扩增所有的mRNA、生成cDNA群体,再用测序凝胶电泳获取所需要的目的基因,然后再次用PCR扩增.简单的讲,就是从基因的转录产物mRNA来反转录成cDNA作为目的基因.
5、用机械的方法,例如超声波把基因组打成片段.