求细胞复苏方法步骤和注意事项细胞复苏如何进行,有哪些需要注意的事项?
来源：学生作业帮助网 编辑：六六作业网 时间：2024/11/16 22:31:24
求细胞复苏方法步骤和注意事项细胞复苏如何进行,有哪些需要注意的事项?
求细胞复苏方法步骤和注意事项
细胞复苏如何进行,有哪些需要注意的事项?
求细胞复苏方法步骤和注意事项细胞复苏如何进行,有哪些需要注意的事项?
博凌科为【材料】1.常规细胞培养仪器设备 恒温水浴振荡器.2.培养液（DMEM）胎牛血清（CBS）二甲基亚砜（DMSO）【操作程序】1.细胞实验室进行常规消毒,紫外照射40min以上.2.培养液（DMEM）、0.25％胰蛋白酶（Trypsin）恒温水浴箱370C预热20min,备用.3.二甲基亚砜（DMSO)在40C冰箱中冷藏30min,备用.4.从液氮保存罐中取出冻存管,立即放入400C水浴中,快速摇晃,直至冻存液完全融化.5.将细胞悬液移入15ml离心管,缓慢加入4ml培养液,离心（1000r/min,5min）.6.用培养液悬液混悬沉淀细胞,调整细胞浓度,方培养箱中培养.7.记录复苏日期.【注意事项】1.取细胞的过程中注意带好防冻手套,护目镜.此项尤为重要,细胞冻存管可能漏入液氮,解冻时冻存管中的气温急剧上升,可导致爆炸.2.冻存液的问题：冻存液的配置已是常识,在这里不作详述,但二甲基亚砜（DMSO）对细胞不是完全无毒副作用,在常温下,二甲基亚砜对细胞的毒副作 较大,因此,必须在1-2min内使冻存液完全融化.如果复苏温度太慢,会造成细胞的损伤,二甲基亚砜（DMSO）最好选择进口产品.3.离心前须加入少量培养液.细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高,注意加入少量培养液可稀释其浓度,以减少对细胞的损伤.4.离心问题：目前主要有两种见解.一种是解冻后的细胞悬液直接吹打均匀后分装到培养瓶中进行培养,第二天换液.因为离心的目的是两个,去除 DMSO,去除死细胞,这个是标准流程,但对一般人来说,把握不好离心转速和时间,转的不够活细胞沉底的少,细胞就全被扔掉了,转过了活细胞会受压过大, 死亡.此外在操作过程中容易污染,所以不推荐.另一种说法为细胞悬液中含有二甲基亚砜（DMSO）,DMSO对细胞有一定的毒副作用,所以须将离心后的液 体前倒净,且一定倒干净.我在试验中按照常规的离心分装的方法进行复苏,结果无有异常.5.细胞贴壁少的问题：教科书中说明冻存细胞解冻时1ml细胞液要加10ml－15m培养液,而在我的试验中的经验总结为培养基越少细胞越容易贴附.6.复苏细胞分装的问题：试验中我的经验总结为复苏1管细胞一般可分装到1-2只培养瓶中,分装过多,细胞浓度过低,不利于细胞的贴壁.7.加培养基的量放入问题：这个量的多少的把握主要涉及到的问题是DMSO的浓度,从如果你加培养基的太少,那么DMSO的浓度就会比较大,就会影响 细胞生长,从以前的资料来看,DMSO的浓度在小于0.5%的时候对一般细胞没有什么影响,还有一个说法是1％.所以如果你的冻存液的浓度是 10％DMSO的话那么加10ml以上的培养基就恰好稀释到了无害浓度.