真空镀膜与喷镀有什么区别

真空镀膜与喷镀有什么区别
真空镀膜与喷镀有什么区别

真空镀膜与喷镀有什么区别
电子显微镜的诞生和发展大大推动了人们对微观世界的研究.借助电镜技术,人们可以认识亚显微结构和超微结构.离体培养细胞具有活力好、层次薄和易于取材、固定效果好等优点,非常适宜于电镜观察.随着电子显微镜技术的发展,当今的电镜技术已包括了透射电镜超薄切片技术与观察,扫描电镜样品制备技术与观察,电镜细胞化学技术,电镜免疫细胞化学技术,电镜X射线显微分析技术和电镜图像立体定量分析技术等,既可观察细胞形态、结构,也可了解功能,并进行定性与定量分析.一、透射电镜细胞样品制备技术和观察方法(一)原理透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)是利用阴极发射的电子,通过阳极中央的微孔形成的电子束穿透样品获得样品的电子信号,经物镜、中间镜和投影镜等多级电子放大至数百至数千万倍,最后成像在荧光屏上便可即时观察,或是投射到照相底片感光片上作为永久记录.由于标本必须置于高真空中进行电镜观察,所以电镜观察的生物标本必须特殊制备,不能含水,离体的生物标本要迅速加以固定,以防产生结构改变.另外,电子的穿透力很弱,这就需要把样品制成50nm～100nm厚的超薄切片(一个细胞切成100～200片).为了使柔软的生物组织能够制成这样薄的切片,并使切片耐受高真空和电子轰击,所以在切片前要进行包埋.超薄切片技术是透射电镜观察成功的关键.超薄切片制作样品过程大体分为取材、固定、漂洗、脱水、渗透包埋与聚合、切片、染色等.细胞超薄切片技术中如何把细胞完整无损地从培养瓶皿壁上包埋下来是最大的难题.新的定型产品无菌聚苯乙烯塑料薄膜的使用解决了这个难题,把薄膜放在培养瓶皿中,让细胞直接长在塑料薄膜上,不仅细胞生长效果好,而且可与细胞一起包埋切片,省去了许多麻烦.(二)超薄切片基本操作步骤1、取材(1)离心法 适用于悬浮生长细胞或单层生长细胞,欲观察细胞内部超微结构,取对数生长期的细胞低速离心,令细胞沉于锥形离心管底部,吸除上清液,立即加戊二醛固定.(2)原位法 将无菌的聚苯乙烯薄膜(已消毒包装的成品)剪成适宜的小块置入培养瓶中,然后接种细胞悬液,待细胞附于薄膜上并生长后,取出进行固定.2、 固定 将离心管中的细胞团块或取出的薄膜移入青霉素小瓶中,在4℃用PBS漂洗3次,每次10分钟.再用1% 四氧化锇在4℃固定15～30分钟,接着用PBS漂洗3次.3、 脱水 用系列丙酮在室温下脱水.50% 丙酮溶液1次,10分钟.70% 丙酮溶液1次,10分钟.90% 丙酮溶液2次,每次10分钟.100% 丙酮溶液3次,每次10分钟.4、 浸透 吸弃瓶中脱水剂,加3mL纯丙酮-EPON812包埋剂(1:1体积比),室温下放置30分钟后,弃去稀释的包埋剂,加纯包埋剂1mL,室温放置2小时或过夜.5、包埋(1)细胞团块 吸取混合包埋剂滴2滴于2号胶囊模块孔的底部,把细胞团块移入胶囊底部中心,注满混合包埋剂,放60℃烤箱烘烤2小时,使之固化成硬块.(2)细胞薄膜 将预先干燥的EPON明胶囊注满混合包埋剂,倒盖在单层细胞上,在60℃固化24小时.6、修块 将包埋块安装在特制的夹具上,在显微镜下用单刃刀片修整去除表面的包埋剂,并做记号以便定位.7、切片 先将包埋块固定在超薄切片机上,切厚约1μm的半薄切片,用苏木素-伊红染色法染色.镜下观察细胞图像,确定进行超薄切片的部位,并作标记.准备φ3mm,150～200目的铜网,用清洗液清洗,并用无水乙醇脱水干燥.制备好支持膜,小心放在铜网上.在超薄切片机上安装三角形玻璃刀,固定包埋块,切取50～70nm厚度的超薄切片,用睫毛笔挑选切片并用钢丝环套取切片,贴在铜网有支持膜的一侧,保存在干燥器皿中待染色.8、电子染色：用一干净培养皿,内放干净的牙科石蜡片.在石蜡片上加1至数滴醋酸钠染色液,用镊子夹住载网边缘,把贴有切片的一面朝下,使载网浮在液滴上,盖上培养皿染色5～30分钟,染色后尽快用双蒸水清洗三次.用滤纸吸去载网多余的水分,置培养皿内自然干燥.再将载网放在另一只备有蜡片的培养皿中以同样方法进行柠檬酸铅的染色及清洗.片染后凉干待观察.二、扫描电镜细胞样品制备(一)原理超薄切片实际上是样品的二维切片,不能表达细胞的三维结构,而且在观察由切片所拍摄的显微照片时,容易造成错误