如何选择siRNA的悬垂组成?
来源：学生作业帮助网 编辑：六六作业网 时间：2024/12/22 13:11:46
如何选择siRNA的悬垂组成?
如何选择siRNA的悬垂组成?
如何选择siRNA的悬垂组成?
Small interfering RNA (siRNA)：是一种小RNA分子（~21-25核苷酸）,由Dicer（RNAase Ⅲ家族中对双链RNA具有特异性的酶）加工而成.SiRNA是siRISC的主要成员,激发与之互补的目标mRNA的沉默.
siRNA原理:
RNA干涉（RNAi）在实验室中是一种强大的实验工具,利用具有同源性的双链RNA（dsRNA）诱导序列特异的目标基因的沉寂,迅速阻断基因活性.siRNA在RNA沉寂通道中起中心作用,是对特定信使RNA（mRNA）进行降解的指导要素.siRNA是RNAi途径中的中间产物,是RNAi发挥效应所必需的因子.siRNA的形成主要由Dicer和Rde-1调控完成.由于RNA 病毒入侵、转座子转录、基因组中反向重复序列转录等原因,细胞中出现了dsRNA,Rde-1(RNAi缺陷基因-1)编码的蛋白质识别外源dsRNA,当dsRNA达到一定量的时候,Rde-1引导dsRNA与Rde-1编码的Dicer（Dicer是一种RNaseIII 活性核酸内切酶,具有四个结构域：Argonaute家族的PAZ结构域,III型RNA酶活性区域,dsRNA结合区域以及DEAH/DEXHRNA解旋酶活性区）结合,形成酶-dsRNA复合体.在Dicer酶的作用下,细胞中的单链靶mRNA（与dsRNA具有同源序列）与dsRNA的正义链互换,原来dsRNA中的正义链被mRNA代替而从酶-dsRNA复合物中释放出来,然后,在ATP的参与下,细胞中存在的一种RNA诱导的沉默复合体RNA-induced silencing complex （RISC,由核酸内切酶、核酸外切酶、解旋酶等构成,作用是对靶mRNA进行识别和切割）利用结合在其上的核酸内切酶的活性来切割dsRNA上处于原来正义链位置的靶mRNA分子中与dsRNA反义链互补的区域,形成21-23nt的dsRNA小片段,这些小片段即为siRNA.RNAi干涉的关键步骤是组装RISC和合成介导特异性反应的siRNA蛋白.siRNA并入RISC中,然后与靶标基因编码区或UTR区完全配对,降解靶标基因,因此说siRNA只降解与其序列互补配对的mRNA.其调控的机制是通过互补配对而沉默相应靶位基因的表达,所以是一种典型的负调控机制.siRNA识别靶序列是有高度特异性的,因为降解首先在相对于siRNA来说的中央位置发生,所以这些中央的碱基位点就显得极为重要,一旦发生错配就会严重抑制RNAi的效应.
siRNA有如下特点：
1.长度约在22nt左右.
2.依赖Dicer酶的加工,是Dicer的产物,所以具有Dicer产物的特点.
3.生成需要Argonaute家族蛋白存在.
4.是RISC组分.
5.siRNA合成是由双链的RNA或RNA前体形成的.
6.siRNA是人工体外合成的,通过转染进入人体内,是RNA干涉的中间产物.
7.结构上,siRNA是双链RNA.
8.在Dicer酶的加工过程中,siRNA对称地来源于双链RNA的前体的两侧臂.
9.在作用位置上,siRNA可作用于mRNA的任何部位.
10.在作用方式上,siRNA只能导致靶标基因的降解,即为转录水平后调控.
11.siRNA不参与生物生长,是RNAi的产物,原始作用是抑制转座子活性和病毒感染.
siRNA表达框架(siRNA expression cassettes,SECs)是一种由PCR得到的siRNA表达模版,包括一个RNA pol III启动子,一段发夹结构siRNA,一个RNA pol III终止位点,能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中.和siRNA表达载体不同的是,SECs不需要载体克隆、测序等颇为费时的步骤,可以直接由PCR得到,不用一天的时间.因此,SECs成为筛选siRNA的最有效工具,甚至可以用来筛选在特定的研究体系中启动子和siRNA的最适搭配.