你知道变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的那个胶是怎么配置的?需要哪些必备药品?还有用水平电泳可以吗?

你知道变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的那个胶是怎么配置的?需要哪些必备药品?还有用水平电泳可以吗?
你知道变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的那个胶是怎么配置的?需要哪些必备药品?还有用水平电泳可以吗?

你知道变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的那个胶是怎么配置的?需要哪些必备药品?还有用水平电泳可以吗?
我把我们实验室的实验讲义发给你,供你参考.
你做的应该是蛋白质的电泳吧,只能用垂直电泳.水平电泳用于分离DNA或RNA.
实验十一 SDS-PAGE检测表达蛋白
1．目的
学习SDS-PAGE的基本操作,学会用SDS-PAGE检测蛋白.
2．原理
蛋白质在加热变性以后与SDS结合,带上负电荷,在电场的作用下,向正极移动,结果按分子量大小排列在胶板上,含量多的蛋白带纹粗.
3．器材
旋涡混合器,微量移液取样器,移液器吸头,1.5ml 微量离心管,双面离心管架,台式冷冻离心机,制冰机,超声波破碎仪,电磁炉,电泳仪,垂直电泳槽及配套的玻璃和密封条、梳子等,摇菌试管,三角烧瓶,接种环,饭盒.
4．试剂
SDS（十二烷基磺酸钠）,Acr（丙烯酰胺）,Bis（N,N’-亚甲基双丙烯酰胺）,Tris（三羟甲基氨基甲烷）,甘氨酸,盐酸,Aps（过硫酸氨）,TEMED（四甲基乙二胺）,蛋白分子量标准（97.4,66.2,43,31,20.1,14.4 kDa）,溴酚蓝,甘油,冰醋酸,乙醇,b-2-巯基乙醇,考马斯亮蓝R250,甲醇,乙醇.
5．实验准备
1.0mol/L Tris HCl,pH8.8（4°C保存）；0.5mol/L Tris HCl,pH6.8（4°C保存）；10%SDS（室温保存）；30%Acr/Bis（30g Acr+0.8g Bis dd water 定容至100mL,4°C保存）；10%Aps （-20°C保存）；2´上样缓冲液（0.5mol/L Tris HCl,pH6.8 2mL,甘油2mL,20%SDS 2mL,0.1%溴酚蓝 0.5mL,b-2-巯基乙醇 1.0mL,dd water 2.5mL,室温存放）；5´电泳缓冲液（Tris 7.5g ,甘氨酸36g,SDS 2.5g,加dd water至500mL,使用时稀释五倍）；考马斯亮蓝染色液（考马斯亮蓝R250 0.25g + 45ml甲醇+10mL冰醋酸,用dd water定容至100mL）；脱色液（95%乙醇：冰醋酸：水= 4.5：0.5：5,体积比）；
6．操作步骤
（1） 将表达后的菌体与2´上样缓冲液按1：1混匀于微量离心管中.
（2） 用超声波破碎仪脉冲10次,每次10秒.中间间隔时放入冰中降温.注意一定要将超声波探头插入容液底部,在溶液表面或上部时容易起泡!
（3） 将上述微量离心管插入水漂中,放在电磁炉锅里的沸水中煮3~5min.然后立即插入冰中.（可在-20°C冰柜中保存）.
（4） 组装电泳玻璃并用细橡胶管密封底部和侧面然后用夹子夹住（观察教师的演示）.插入梳子后在玻璃上距离梳子齿底部1cm的地方做一个标记.
（5） 配制10%分离胶.按顺序和量取下列溶液混在一个50mL的小烧杯中（注意Tris为 pH8.8）：
Acrylamide-bis 3.96 mL
1M Tris PH8.8 4.38 mL
d.d Water 3.432 mL
10% SDS 118.8 mL
TEMED 9.9 mL
10%APS 118.8 mL
（6） 加完APS后拿起烧杯轻轻转动几下底部将溶液混匀后,立刻缓缓倒入玻璃夹缝中,直到液面与所作的标记齐平.剩下的胶液留在小烧杯中,倾斜放置.然后在上部用1000ml微量移液器轻轻地沿玻璃壁来回移动加满dd water（尽可能不破坏下面的胶液）.然后静置30min.直到烧杯中剩余的溶液凝固.倒出蒸馏水,并倒置玻璃尽可能将水倒尽.
（7） 配支持胶.按顺序和量（注意体积单位!）取下列溶液混在一个50mL的小烧杯中（注意Tris为 pH6.8）：
Acrylamide-bis 0.675 mL
0.5M Tris pH6.8 0.563 mL
dd water 3.165 mL
10% SDS 45 mL
TEMED 7.5 mL
10% APS 45 mL
（8） 加完APS后拿起烧杯轻轻转动几下底部将溶液混匀后,立刻倒入玻璃夹缝中,液面与玻璃上边缘齐平.然后再慢慢插入梳子,静置约20min.烧杯中剩下的溶液倾斜放置直到溶液凝固.（此状态可以用塑料薄膜包起来放入冰箱过夜）.
（9） 小心拔出梳子以后,用注射器针头（剪平尖部）吸取梳子齿形成的加样槽中的水,并修平加样槽底部的胶面.
（10） 选取几个形态好的加样槽,在一张纸上做好对应的标记,用微量移液器在侧面的一个加样槽中加入20mL 蛋白分子量,其它槽中加入10～20mL自己制作的样品.
（11） 加完样品后,再用微量移液器吸取电泳缓冲液小心把加样槽液面都补平.电泳槽上部倒满电泳缓冲液（约250ml,淹没过加样槽的液面!）,电泳槽的下部倒入一半电泳缓冲液（约180ml）.
（12） 接好电极,将电流调至10mA,待溴酚蓝移到分离胶后,在将电流调至18mA,电泳约2~3h,期间随时观察电泳槽上部的液体是否有泄漏（泄漏导致液面下降,电流中断）!当溴酚蓝移到玻璃距底部0.5cm时切断电源.
（13） 在一个搪瓷盘里准备适量的考马斯亮蓝染色液.
（14） 倒掉电泳槽中的缓冲液,取下玻璃,小心用铲子从下部将带有缺口的玻璃板撬起（切不可损坏胶!）.用铲子切去上部的支持胶,并把分离胶从玻璃上剥离倒染液搪瓷盘里（切不可损坏胶!）.
（15） 染色2h后,在将染液倒回瓶子里以备重复使用.在饭盒里倒入脱色液,过夜.
（16） 观察脱色后胶里的蓝色带纹,与对照比较或寻找异常粗的带纹,并比较其分子量,判断是否是预期的基因产物.
（17） 清理桌面,写实验报告.