设计培养基有什么基本原则.有什么现代人设计的成功的培养基,能举个例子吗?

设计培养基有什么基本原则.有什么现代人设计的成功的培养基,能举个例子吗?
设计培养基有什么基本原则.
有什么现代人设计的成功的培养基,能举个例子吗?

设计培养基有什么基本原则.有什么现代人设计的成功的培养基,能举个例子吗?
（一）四个原则
1．目的明确在设计新培养基前,首先要明确配制该培养基的目的,例如,要培养何菌?获何产物?用于实验室作科学研究还是用于大规模的发酵生产?作生产中的“种子”,还是用于发酵?等等.
如果某培养基将用于实验室研究,则一般不必过多地计较其成本.但必须明确对该培养基是作一般培养用,还是作精细的生理、代谢或遗传等研究用.如属前者,可尽量按天然培养基的要求来设计,如系后者,则主要应考虑设计一种组合培养基（即“合成培养基”,详后）.拟培养的微生物对象也十分重要.不同大类的微生物,对培养基中碳源与氮源间的比例、pH的高低、渗透压的大小、生长因子的有无以及特殊成分的添加等都要作相应的考虑.
如果某培养基将用于大规模的发酵生产上,则用作“种子”的培养基,一般其营养成分宜丰富些,尤其氮源的含量应较高（即C／N比低）；相反,如拟用作大量生产代谢产物的发酵培养基,则从总体来说,它的氮源含量宜比“种子”培养基稍低（即C／N比高）.除了对不同类型的微生物应考虑其特定条件外,在设计发酵培养基时,还应特别考虑到生产的代谢产物是主流代谢产物,或是次生代谢产物.如属主流代谢产物（一般指通过主要代谢途径产生的那些结构较简单、产量较高、价值较低的降解产物）,则生产不含氮的有机酸或醇类时,培养基中所含的碳源比例自然要比生产含氮的氨基酸类产物时高,反之,生产氨基酸类含氮量高的代谢产物时,氮源的比例就应高些.如属生产次生代谢产物（一般是指通过复杂合成途径产生的那些结构复杂、产量低、价值高的合成产物）,例如抗生素、维生素或赤霉素等,则还要考虑是否在其中加入特殊元素（如维生素B12中的Co）或特定前体物质（如生产苄青霉素时加入的苯乙酸）.
2．营养协调通过菌体成分的分析,可知道在各种微生物的细胞中,其不同成分或元素间是有较稳定比例的（表5-15）；另外,在异养微生物中,碳源还兼作能源,而能源的需要量是很大的.这两点就是确定培养基中各种营养要素的数量和比例的重要依据.此外,如果设计的培养基是用于生产大量代谢产物的,那么,它所需耗费的营养物的量也要在设计培养基时予以充分考虑.
业已清楚,在大多数化能异养菌的培养基中,各营养要素间在量上的比例大体符合以下十倍序列的递减规律：
要素：H2O＞C+能源＞N源＞P、S＞K、Mg＞生长因子
含量：（～10-1）（～10-2）（～10-3）（～10-4）（～10-5）（～10-6）
从中可以看出：①水分含量最高,这是因为微生物多数是水生性的,它们的aw值（详后）高；②碳源的含量其次,这是因为碳元素在任何细胞有机物中都是含量最高的,同时,碳源还兼有能源的作用,而能源的消耗量是很大的；③N、P、S、K、Mg的含量依次递减,这是与它们分别在细胞组分中的含量是相符的；④生长因子的量最少,这是与它的生理功能相一致的.
在上述序列中,碳源与氮源间的相对比例即碳氮比（C／N比）,它有着十分重要的意义.严格地讲,C／N比是指在微生物培养基中所含的碳源中碳原子的摩尔数与氮源中氮原子的摩尔数之比,而不能简单地理解为某碳源的重量与某氮源的重量之比.这是因为,不同种类的碳源或氮源,其中的含碳量或含氮量差别很大,从以下五种常用氮源的含氮量占总重量的比例即可明白其中的道理：
NH3（含氮量82％）＞CO（NH2）2（46％）＞NH4NO3（35％）＞（NH4）2CO3（29.2％）＞（NH4）2SO4（21％）这说明在同样重量时,在以上各氮源中含氮量以氨为最高,尿素次之,硝酸铵和碳酸铵更次之,而硫酸铵则最低.
据记载,一般培养基的C／N比为100／0.5～2；谷氨酸发酵培养基为100／11～21,放线菌蛋白酶培养基为100／10～20.
3．物理化学条件适宜
（1）pH 各大类微生物一般都有它们合适的生长pH范围.细菌的最适pH在7.0～8.0间,放线菌在7.5～8.5间,酵母菌在3.8～6.0间,而霉菌则在4.0～5.8间.对于具体的微生物种来说,它们都有特定的最适pH范围,有时可大大突破上述一般界限（见第七章第三节）.
由于在微生物生长繁殖过程中会产生引起培养基pH改变的代谢产物,尤其是不少的微生物有很强的产酸能力,如不适当地加以调节,就会抑制甚至杀死其自身,因而在设计它们的培养基时,就要考虑到培养基的pH调节能力.这种通过培养基内在成分发挥的调节作用,就是pH的内源调节.
内源调节主要有以下两种方法：
第一种是采用磷酸缓冲液的方式.调节K2HPO4和KH2PO4两者浓度比就可获得从pH6.0至7.6间的一系列稳定的pH,当两者为等摩尔浓度比时,溶液的pH可稳定在pH6.8.其反应原理如下：
K2HPO4＋HCl→KH2PO4＋KCl
KH2PO4＋KOH→K2HPO4＋H2O
第二种是采用加入CaCO3作“备用碱”的方式.CaCO3在水溶液中溶解度极低,加入至液体或固体培养基中时,不会使培养液的pH升高.但当微生物生长过程中不断产酸时,它就逐渐被溶解,并发生以下反应：
因为CaCO3是不溶性且是沉淀性的,故在配成的培养基中分布很不均匀,如因实验需要,也可用NaHCO3来调节：
与内源调节相对应的是外源调节,这是一种按实际需要不断流加酸液或碱液到培养液中去的调节方法.具体内容将在第七章第三节中进行讨论.
（2）渗透压和aw 渗透压（osmoticpressure）是可用压力来量度的一个物化指标,它表示两种浓度不同的溶液间被一个半透性薄膜隔开时,稀溶液中的水分子会透过此膜到浓溶液中去,直到浓溶液产生的机械压力足以使两边的水分子进出达到平衡为止,这时由浓溶液中的溶质所产生的机械压力,即为渗透压.渗透压的大小是由溶液中所含有的分子或离子的质点数所决定的,等重的物质,其分子或离子越小,则质点数越多,因而产生的渗透压就越大.
等渗溶液适宜微生物的生长,高渗溶液会使细胞发生质壁分离,而低渗溶液则会使细胞吸水膨胀,对细胞壁脆弱或丧失的各种缺壁细胞（如原生质体、球状体,支原体）来说,在低渗溶液中还会破裂.
微生物在其长期的进化过程中,发展出一套高度适应渗透压的特性,尤其会通过体内大分子贮藏物的合成或分解的方式来适应.据测定,革兰氏阳性细菌的内渗透压约可达到20个大气压,而革兰氏阴性细菌也可达到5～10个大气压.
比渗透压更有生理意义的一个物化指标是aw即水活度（wateractivity）.它表示在天然环境中,微生物可实际利用的自由水或游离水的含量.要定量地表示水活度,则其含义为：在同温同压下,某溶液的蒸汽压（P）与纯水蒸汽压（P0）之比.因此,aw也等于该溶液的百分相对湿度（ERH,equilibriumrelativehumidity）值.即：
各种微生物生长繁殖范围的aw值在0.998～0.6之间.若干有代表性微生物的最低aw值是：
知道了各类微生物生长的aw值,不仅有利于设计它们的培养基,而且对防止食物的霉腐也有重要的意义.现将若干食物的aw值列举如下：
（3）氧化还原势 氧化还原势（redoxpotential）又称氧化还原电位,是度量某氧化还原系统中的还原剂释放电子或氧化剂接受电子趋势的一种指标,其单位是V（伏）或mV（毫伏）.氧化还原势的表示方法Eh或rH2两种.
Eh指以氢电极为标准时某氧化还原系统的电极电位值.标准氢电极是一个半电池,它由pH为零的HCl溶液、涂满铂黑的铂箔电极和用压力为1个大气压的氢所组成的.在这种条件下,此标准氢电极的电极电位等于零.在溶液中的某氧化还原偶,当其氧化型和还原型的浓度相等时,所产生的氧化还原势可用E0表示.任何氧化还原系统所产生的氧化还原势明显地受pH的影响.在生物体系中,常用E′来表示pH为7时某氧化还原偶的氧化还原势.氢电极E′的上限是+0.82V,它出现在高氧且没有氧消耗的环境中,下限为-0.42V,出现在富含氢的环境中.
任何一对由氧化态物质与还原态物质组成的氧化还原偶,在pH等于7的情况下会产生一定的氧化还原势,其数值可借它与一个标准氢电极间所呈现出来的电位差值来测出.由于氢电极在使用时极感不便,因此,实际上常用甘汞电极作参比电极来进行测定.某一氧化还原系统在30℃下所产生的氧化还原势数值为：
上式中的n为反应中所传递的电子数,〔ox〕为测定系统中某氧化态物质的浓度,〔red〕为该还原态物质的浓度.
rH2表示氢分子浓度的负对数,这一概念与pH是氢离子浓度的负对数的概念有类似之处.其数值为：
rH2的范围自0（氢浓度等于1个大气压）至42.6（氧浓度为1个大气压）.这就意味着,某溶液的rH2值越低,它的还原力越强,反之,如rH2值越高,则其氧化性越强.从式中还可以看出Eh、rH2与pH值三者间的关系.当Eh值不变时,pH值越高,rH2亦越高,pH值越低,则rH2值亦越低.在许多氧化还原系统中,每降低一个pH值,就相当于提高Eh值0.06V.
就像微生物与pH的关系那样,各种微生物对其培养基的氧化还原势也有不同的要求.一般地说,适宜于好氧微生物生长的Eh值为+0.3～+0.4V,它们在Eh值为0.1V以上的环境中均能生长；兼性厌氧微生物在＋0.1V以上时进行好氧呼吸,在+0.1V以下时则进行发酵；厌氧微生物只能在+0.1V以下才能生长.
微生物的培养基常常是一个具有多对氧化还原偶的复杂电化学系统,这时所能测出的Eh值仅代表了它们的综合结果.在各对氧化还原偶中,对微生物生长繁殖影响最大的是分子氧与分子氢的浓度,它们对严格厌氧菌的影响尤为重大.要培养它们,除了在配制培养基、灭菌、接种和培养等一切操作过程中必须采用严格厌氧技术（见第七章第三节）以去除氧气外,还要在培养基中加入一定量的还原剂,例如可用巯基乙酸（0.01～0.20％）、抗坏血酸（0.1％）、硫化钠（0.025％）、半胱氨酸（＜0.05％）、葡萄糖（0.1～1.0％）、铁屑、谷胱甘肽、氯化高铁血红素、二硫苏糖醇或庖肉（瘦牛肉小块）等来降低它的氧化还原势值.据测定,加了铁屑的培养基,其Eh值可降到－0.40V的水平.
除测定电极电位外,培养基中的Eh值还可使用氧化还原指示剂如刃天青（resazurin）等来测定.刃天青在培养基中的加入量一般为1mg／L（1ppm）.它在无氧条件下呈无色状态,这时的Eh值相当于－40mV左右；在有氧条件下,其颜色与溶液的pH有关（中性时呈紫色,碱性时呈蓝色,酸性时呈红色）；在微量氧时,它呈粉红色.刃天青的变色反应机理是：
不论是好氧微生物还是厌氧微生物,随着它们的生长和代谢活动的进行,培养基的最初氧化还原势常会逐步下降.其原因主要是因为溶解氧和氧化型氢受体的消耗和H2S、H2等还原性代谢产物的形成和累积.图5-2表示在Streptomycesaureofaciens（金霉素链霉菌）K1001的培养过程中,培养液氧化还原势值的变化及其与产生金霉素的关系.
4．经济节约 经济节约主要指在设计生产实践中所使用的大量培养基时应遵循的原则.这方面的潜力是极大的.综合各方面的实际经验,经济节约的原则大体可分为以下八个方面.
（1）以粗代精 一般地说,“粗”与“精”的概念是人为划分的.对人来说是一种“精”的营养料（如精白糖）,对微生物往往却是一种不完全的养料,而对一般人只认为是“粗”的营养料（如红糖）,对微生物倒反而是一种较完全的养料.从这一点出发,就可以在设计培养基时充分利用各种粗原料.
（2）以“野”代“家” 主要指以野生植物原料代替栽培植物原料.如木薯、橡子、薯芋、土茯苓、金刚刺和苦楝子等都是富含淀粉质的野生植物,可以部分取代粮食用于发酵工业中的碳源；许多含纤维素、半纤维素和木质素等的植物秸秆,可以作为栽培食用菌的良好养料.
（3）以废代好 以工、农业生产中易污染环境的废弃物作为微生物培养基的原料,是大有可为的,例如,造纸厂的亚硫酸废液（含有戊糖和短小纤维）、各种发酵废液（酒精及丙酮丁醇发酵废醪、味精发酵废液）、各种酿造工业废弃物（啤酒糟、酒糟、酱渣）以及其他工业废弃物（花生麸、淀粉渣、胚芽饼、豆腐渣、屠宰水、黄浆水、蚕茧脱胶废水、粉丝厂废水）等.在利用这类原料生产酵母菌等单细胞蛋白方面,国内外已有很多成功的例子.
（4）以简代繁 生产上在改进培养基成分时,一般都以“加法”居多,即设法使其营养越来越丰富、含量越来越高.这对微生物的生长不一定都有利.有时可试用“减法”,即用稀薄的培养基或成分较少的培养基来代替原有培养基成分,以求达到更好的效果.例如,某制药厂在改进链霉素发酵培养基原有配方中,曾设法减去30～50％的黄豆饼粉、25％葡萄糖和20％硫酸铵,结果反而提高了产量（表5-16）；又如,某厂在卡那霉素发酵培养基中将原来的12种成分减少为7种,结果仍可维持原有的产量.
（5）以烃代粮 即以石油或天然气代替糖质原料来培养微生物.能利用石油作为碳源和能源的微生物在自然界中普遍存在,据知至少有8属细菌、6属放线菌、6属酵母和6属霉菌能利用石油.不同的微生物几乎能利用石油中所含的所有成分,除了合成菌体成分——石油蛋白外,还能将其氧化成醇、醛、酸等化工产品.在当前石油资源逐渐趋向紧缺的情况下,如能拿出一部分石油作发酵原料,让微生物将它转化成一些产值较高的高级醇、脂肪酸和环烷酸等化工产品和若干合成产物,还是十分值得的.
（6）以纤代糖 纤维素是一种由14000个左右的葡萄糖单位构成的β-D-葡萄糖长链,是自然界中最丰富的有机物.可是,人类和动物都无法直接消化这一取之不尽、用之不竭的可再生资源.在自然界中,存在着大量分解纤维素的微生物,它们能分泌各种纤维素酶,例如内-β-1,4-葡聚糖酶（分解大分子中央的β-1,4键,产生含游离末端的长链片段）,外-β-1,4-葡聚糖酶（从纤维素链的末端上不断水解出纤维二糖单位）,以及β-葡糖苷酶（将纤维二糖水解成葡萄糖）.因此,有可能利用这些微生物将大量的农副产品转化成优质饲料、工业发酵原料、燃料以及人类的食品或饮料.例如有的国家利用Candidawickerharmii（维氏假丝酵母）将纤维糊精通过3～4天发酵产生乙醇（54g／L纤维糊精可产生29.2g／L乙醇）；也有用Clostridiumthermocellum（热纤梭菌）在55～60℃下的厌氧条件下将纤维素转化成葡萄糖,然后再转化为乙醇；在日本,有人用厌氧菌Ruminococcusalbus（白色瘤胃球菌）将球磨纤维素（80g／L）发酵产生酒精（18g／L）和醋酸（23g／L）；目前,优良的Trichodermaviride（绿色木霉）变异株每毫升发酵液的纤维素酶活力已超过7500单位；近来,还有人找到一株能利用纤维素生产乙醇的耐热性酵母——Fabosporafragilis（脆弱豆孢酵母）CCY51-1-1.这些都为“以纤代糖”提供了令人鼓舞的应用前景.据估计,我国每年有稻草、麦秆、稻壳、棉子壳和玉米芯五项含纤维素丰富的资源4亿吨以上,如能充分加以利用,这将是一个巨大的生物资源库.
（7）以氮代朊 即以大气氮、铵盐、硝酸盐或尿素等一类非蛋白质或非氨基酸原料用作发酵培养基中的氮源,让微生物转化成菌体蛋白质或含氮的发酵产物供人们利用（见本章第一节“氮源”）.
（8）以“国”代“进” 即以国产原料代替进口原料,这实际上是“以粗代精”原则的一种特殊形式.典型的例子是50年代初在我国建立抗生素工业的早期,因为国内缺乏乳糖及玉米浆这两种青霉素发酵的主要原料而影响到生产的发展.我国学者经过研究,终于找到了以国内资源极其丰富的棉子饼粉或花生饼粉代替玉米浆,以玉米粉代替进口乳糖的新的培养基配方,后来又进一步以流加葡萄糖代替乳糖的新工艺,使青霉素产量超过当时国外乳糖发酵的水平,从而建立了具有中国特色的青霉素发酵工业.
（二）四种方法
1．生态模拟 在自然条件下,凡有某微生物大量生长繁殖的环境,则可认为该处一定具备该微生物生长繁殖所必需的营养和其他条件.因此,就可以模拟该天然基质或直接取用该天然基质（经过灭菌）来培养相应的微生物.在实践中,的确可以利用生态模拟的办法来配制各类“初级的”天然培养基.例如,可用肉汤、鱼汁来培养多种细菌；用水果汁来培养各种酵母菌；用润湿的麸皮、米糠来培养多种霉菌；用米饭或面包来培养根霉；用肥土来培养放线菌；以及用玉米芯来培养脉孢菌（Neurosporaspp.）,等等.
2．查阅文献 一个科学工作者决不能事事都依靠直接经验.多查阅、分析和利用一切文献资料上的对自己直接或间接有关的信息,对设计有自己特色的培养基配方有着重要的参考价值.
3．精心设计 在设计、试验新配方时,常常要进行各项因素的比较或反复试验,因此,工作量是很大的.为了提高工作效率,应努力借助优选法或正交试验设计法等行之有效的数学工具.
4．试验比较 要设计一种优化的培养基,在上述三个方法的基础上,最终还得通过实际试验和比较来加以确定.试验的规模一般都遵循由定性到定量、由小而大地逐步扩大的原则.例如,可先在培养皿上作生长谱试验（auxanographicmethod）,然后进行摇瓶培养试验,再进行台式发酵罐试验,最后才扩大到试验型发酵罐和生产型发酵罐的规模.
生长谱试验的基本操作是这样的：如果我们要试的是某一微生物的碳源,则先准备一个不加碳源的琼脂培养基,待融化并冷却至45℃左右时,混入供试菌悬液,摇匀后倒成琼脂平板,俟其凝固后,将待试碳源一一用小镊子夹取少许并整齐地放在平板上.经温箱培养适当时间后,凡在某碳源周围出现该菌的“生长圈”者,即为它可利用的碳源.用同样原理也可寻找合适氮源和生长因子.