求助：分子生物学考博试题：在大肠杆菌中表达动物激素的基因可能遇到的问题及解决方法
来源：学生作业帮助网 编辑：六六作业网 时间：2024/11/24 19:30:28
求助：分子生物学考博试题：在大肠杆菌中表达动物激素的基因可能遇到的问题及解决方法
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求助：分子生物学考博试题：在大肠杆菌中表达动物激素的基因可能遇到的问题及解决方法
答：要使动物中编码激素的基因在大肠杆菌中表达,通常遇到的问题有：
(1)细菌的RNA聚合酶不能识别真核生物的启动子.
(2)大多数真核基因有内含子,这些内含子在转录后从前体mRNA中被切除而形成成熟mRNA.细菌细胞没有这样的机制来去除内含子.
(3)有些真核生物的蛋白质是通过前体分子加工而来的,例如胰岛素就是通过加工去除 前体分子内部的33个氨基酸残基而来,剩下的两段肽链分别形成胰岛素的a、b链.
(4)产生的真核生物的蛋白质产物可以被细菌的蛋白酶所识别和降解.
针对上述可能出现的问题,建议在克隆的过程中采取以下措施：
①应将激素的编码序列置于含有核糖体结合位点和起始密码子ATG的细菌强启动子的附近(含有这种序列的载体称表达载体).
②可以以激素的mRNA为模板用反转录酶合成激素的基因.这种DNA不含内含子可插入到载体中进行克隆.此外,如果蛋白质序列短则可通过化学合成得到该基因.合成的基因应含起始密码ATG、通过该激素蛋白的氨基酸序列推测而来的编码序列,以及1~2个终止密码：
ATG——————编码序列————————TGA TAG
现在,这个合成基因可被插入载体中.
③有时加工过程可以在离体条件下进行.如果加工有困难,可以用合成基因,从而免除加工过程.
④选用合适的突变型宿主从而防止蛋白酶水解.如果用酵母作为宿主上述许多问题都可以较容易地解决,尤其是现在有既能在大肠杆菌中又能在酵母中复制的穿梭质粒载体.
说明：1)ATG,TAG和TGA是对应mRNA中的转录起始信号AUG和终止信号UAG,UGA的DNA序列.
2)克隆生长素释放抑制因子基因时采用化学合成基因的方法.生长索释放抑制因子是一种由下丘脑分泌的激素,长14个氨基酸残基,因此人工合成的基因,包括在宿主菌中表达所需的转录的起始和终止信号,仅51bp长.