复制DNA 的作用是什么

复制DNA 的作用是什么
复制DNA 的作用是什么

复制DNA 的作用是什么
DNA复制是指DNA双链在细胞分裂以前进行的复制过程,复制的结果是一条双链变成两条一样的双链（如果复制过程正常的话）,每条双链都与原来的双链一样.这个过程是通过名为半保留复制的机制来得以顺利完成的.

dna复制时解螺旋从ATP中获得能量

三、RNA引物
目前所发现的DNA聚合酶都需要一个具3′-OH的引物，才能将合成原料dNTP一个一个接上去。因为DNA聚合酶不能催化两个游离的dNTP在DNA模板上进行聚合，如图12-3所示。实验又发现抑制RNA聚合酶的药物如利福霉素(rifampicin)能抑制DNA的复制。再者在体外DNA复制实验中发现冈崎片段的5′端都有一小段4~12个核苷酸的RNA引物(RNA primer)。现知...

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三、RNA引物
目前所发现的DNA聚合酶都需要一个具3′-OH的引物，才能将合成原料dNTP一个一个接上去。因为DNA聚合酶不能催化两个游离的dNTP在DNA模板上进行聚合，如图12-3所示。实验又发现抑制RNA聚合酶的药物如利福霉素(rifampicin)能抑制DNA的复制。再者在体外DNA复制实验中发现冈崎片段的5′端都有一小段4~12个核苷酸的RNA引物(RNA primer)。现知RNA聚合酶合成新链时不需要引物，能直接催化游离NTP聚合。可见RNA引物为DNA聚合酶提供聚合新核苷酸所需的3′-OH。RNA引物最后被DNA聚合酶Ⅰ除去，留下的空隙也由该酶补满，缺口再由DNA连接酶封口。
在DNA的复制需要RNA引物呢，除了DNA聚合酶不能催化两个游离dNTP的聚合，而RNA引物酶却具有此能力外，这种作用尚可尽量减少DNA复制起始处的突变。因为游离核苷酸起始处的聚合最容易出现差错，若用RNA引物，即使出现差错，由于最后将被DNA聚合酶Ⅰ切除，便可提高DNA复制的真实性。
四、引发体
引发体(primosome)是由多种蛋白质及酶组成，是DNA复制开始所必需的。引发体中的某些蛋白质如DnaA能结合至DNA复制起始部位，DnaB具有解链酶的作用，DnaC辅助DnaB结合到复制起始点，使起始部位的双链解开。而引发体中的引物酶(primase)在已解开起始部位的DNA单链按碱基互补配对催化NTP聚合，合成一小片段的RNA，作为DNA合成的引物，即沿此引物RNA的3′-OH进行延伸。
四、真核生物端粒DNA的复制
真核生物线性染色体的两个末端称为端粒(telomere)。按上述DNA复制机制新合成子链5′端的那段RNA引物被切除后，必留下一个空缺，假如每次细胞分裂或DNA复制都是如此，端粒将会不断缩短，最终导致关键基因的丧失及种系灭绝的危险，但事实并非如此。那么真核生物一定存在着某种阻止端粒缩短的机制。
(一) 端粒DNA的结构和端粒酶
对端粒DNA序列的分析，发现端粒DNA的3′端是由数百个串联重复GT丰富的短的寡核苷酸序列，如四膜虫的重复序列为-GGGGTT-，人为-AGGGTT-。端粒DNA序列虽不含功能基因，但对维持染色体的稳定性起着重要作用。如果端粒丧失，染色体之间可能出现端-端融合、降解、重排乃至染色体丢失等变化，最后细胞衰亡。
近年来，发现了一种能防止端粒缩短的酶，称为端粒酶(telomerase)，该酶由蛋白质和RNA两部分组成，其中RNA作为合成端粒DNA的模板，端粒酶是目前所知唯一携带RNA模板的逆转录酶，具有种属特异性，例如四膜虫的端粒酶，其RNA部分含159个核苷酸，其中有一段序列为5′-CAACCCCAA-3′可作为合成端粒DNA3′端GT 丰富序列-GGGGTT-模板。人端粒酶的RNA含450个碱基，其中-CUAACCCUAAC-为合成-AGGGTT-的模板。这样可防止细胞分裂时DNA复制端粒的缩短。
端粒、端粒酶和细胞的衰老有密切关系。有人将端粒称为分子钟或有丝分裂钟。但是恶性肿瘤细胞当端粒缩短到某种程度，端粒酶活性又重新出现，对端粒进行补偿，使之永不衰亡，形成恶性增殖。
(二) 端粒酶的作用机制
第四节DNA的损伤与修复
DNA是储存遗传信息的物质。从生物遗传角度来讲，要求在复制过程中保持遗传密码的稳定性，物种才能得以延续。哺乳动物单倍体细胞的基因组由2.9X109 bp DNA组成。动物一生中，从受精卵细胞到个体死亡，这些遗传密码要经过千万次的复制。在物种进化的长河中，DNA复制的次数更是难以计数，而且生物体内外环境都存在着使DNA损伤（DNA damage）的因素。可见，除DNA复制的高度真实性外，还要求某种修复DNA损伤的机制。每一遗传信息都以不同拷贝储存在DNA两条互补链上。因此，若一条链有损伤，可被修复酶切除，并以未损伤的信息重新合成与原来相同的序列，这就是DNA修复（DNA repair）的基础。
但是在漫长的进化过程中，DNA的序列还是会发生改变, 通过复制传递给子代成为永久的，这种DNA的核苷酸序列永久的改变称为突变(mutation)。若发生的突变有利于生物的生存则保留下来，这就是进化；若不适应于自然选择(nature selection)则被淘汰，因此生物的进化可以看成是一种主动的基因改变过程，这是物种多样性的原动力。所以，生物的变异是绝对的，修复是相对的。
一、造成DNA损伤的因素
造成DNA损伤的因素有生物体内自发的、亦有外界物理和化学等因素。
(一) 自发的因素
由于DNA分子受到周围环境溶剂分子的随机热碰撞(thermal collision)，腺嘌呤或鸟嘌呤与脱氧核糖间的N-糖苷键可以断裂，使A或G脱落。人体细胞中DNA每天每个细胞要脱落5 000个嘌呤碱，每天每个细胞也有100个胞嘧
啶自发脱氨而成尿嘧啶。
(二) 物理因素
1．紫外线损伤由于嘌呤环与嘧啶环都含有共轭双键，能吸收紫外线而引起损伤。嘧啶碱引起的损伤比嘌呤碱大10倍。损伤是由于嘧啶二聚体的产生，即2个相邻嘧啶碱的C5和C6共价交联，如图12-18所示。
2．电离辐射损伤如X射线和γ射线，可以是辐射能量直接对DNA的影响，或DNA周围的溶剂分子吸收了辐射能，再对DNA产生损伤作用。如碱基的破坏、单链的断裂、双链的断裂、分子间的交联、碱基脱落或核糖的破坏等。
(三) 化学因素
二、DNA损伤的类型
根据DNA分子的改变，可把突变分为下面几种主要类型。
点突变
点突变(point mutation)是DNA分子上一个碱基的变异，可分为：①转换(transition)同型碱基，如一种嘌呤代替另一种嘌呤或一种嘧啶代替另一嘧啶。②颠换(transversation)异型碱基，即嘌呤变嘧啶，或嘧啶变嘌呤。点突变可根据发生在DNA分子的部位，如发生在启动子或剪接信号部位可以影响整个基因的功能；若发生在编码序列，有的可以改变蛋白质的功能如引起镰状红细胞贫血；有的则为中性变化，即编码氨基酸虽变化，但功能不受影响；有的甚至是静止突变，碱基虽变但编码氨基酸种类不变。
缺失
缺失(deletion)是一个碱基或一段核苷酸链乃至整个基因，从DNA大分子上丢失。如有些地中海贫血、生长激素基因缺失，再如上述Lesch- Nyhan综合征是HGPRT基因缺失。
（三）插入
插入(insertion)是一个原来没有的碱基或一段原来没有的核苷酸序列插入到DNA大分子中去，或有些芳香族分子如吖啶(acridine)嵌入DNA双螺旋碱基对中，可以引起移码突变(frame-shift-mutation)，影响三联体密码的阅读方式。
（四）倒位
DNA链内部重组，使其一段方向颠倒。
三、修复机制
光修复机制
这种机制主要存在于低等生物。
1. 不需要光复活酶
光复活酶(photoreactivating enzyme)也称为DNA光修复酶(photolyase)。当280nm紫外线照射DNA产生的嘧啶二聚体，在短波239nm照射下，二聚体即分解成单体。
2. 需要光复活酶紫外线照射使光复活酶激活，能解聚嘧啶二聚体。
切除修复
因不需要光照射，故也称暗修复。DNA引起大的损伤, 包括UV引起的嘧啶二聚体、嘧啶/ 环丁烷二聚体、几个其它类型的碱基加合物、通过曝露于香烟的烟尘在DNA中形成的苯并芘尿嘧啶。一般由切除修复(excision repair)系统修复。该修复途径对所有生物的生存是关键的。在大肠杆菌E.coli中，有一种UV特异的切割酶(excinuclease或UVrABC enzyme)，能识别UV照过产生的二聚体部位。并在远离损伤部位5′端8个核苷酸处及3′端4个核苷酸处各作一切口。像外科手术“扩创”一样，将含损伤的一段DNA切掉。DNA聚合酶Ⅰ进入此缝隙，从3′-OH开始，按碱基配对原则以另一条完好链为模板进行修复。最后由DNA连接酶将新合成的DNA片段与原来DNA链连接而封口 (图12-19) 。真核细胞的切割核酸酶的作用和机制，是与细菌的酶完全类似的方式对嘧啶二聚体切割。切除修复是人体细胞的重要修复形式，有些遗传性疾病如着色性干皮病(xeroderma pigmentosum)，是常染色体隐性遗传性疾病。纯合子患者的皮肤对阳光或紫外线极度敏感，皮肤变干、真皮萎缩、角化、眼睑结疤、角膜溃疡，易患皮肤癌。此病是由于缺乏UV特异内切核酸酶造成的。
(三) 碱基切除修复
每个细胞都有一类DNA糖苷酶(DNA glycosylase)，每一种酶能识别一种DNA分子中改变的碱基，能水解该改变的碱基与脱氧核糖间的糖苷键，使改变的碱基脱落，在DNA上产生一个缺嘌呤或缺嘧啶的位（apurinic-or apyrimidinic-site，AP site）,再藉切除修复机制进行修复。现知至少有20种不同的DNA糖苷酶，各具特异性。如识别胞嘧啶脱氨生成的尿嘧啶，腺嘌呤脱氨基产物，开环的碱基，不同烷基化类型的碱基等。如胞嘧啶脱氨后即成尿嘧啶，若不纠正，可引起类型转换，即G-C→A-T。
碱基切除修复（base-excision repair）步骤如下：
1)DNA糖苷酶识别损伤的碱基,在碱基和脱氧核糖之间切割。
2）AP核酸内切酶切AP位置附近的磷酸二酯键。
3）DNA聚合酶Ⅰ用它的5′→3′外切酶活性除去损伤链,从缺口的3′-OH起始
修复合成,用新合成的DNA替代。
4）最后缺口由DNA连接酶封口(图12-20)。
尿嘧啶DNA糖苷酶修复的发现，解答了一个长年以来的疑题，即组成RNA是U，而组成DNA却是甲基化为T，即从UMP→dTMP，要消耗能量。但U和T都与A互补配对，所编的密码是相同的。生物体为什么花如此代价? 现在问题清楚了，尿嘧啶-DNA糖苷酶只能切除DNA链上的尿嘧啶，而不能切除DNA链上的胸腺嘧啶，因为后者C5有一甲基，好像是给尿嘧啶加上一个标签。胞嘧啶脱氨基后形成的尿嘧啶即无此标签，即被该糖苷酶识别为改变了的碱基。若DNA与RNA一样也用尿嘧啶，那么胞嘧啶脱氨形成尿嘧啶，与正常部位的尿嘧啶便无法区别，不能纠正，造成子代DNA的突变即GC→AT。可见DNA由T代替U，能增加遗传信息的稳定性。相反，RNA不需修复，拷贝数很多，半衰期短，即使有个拷贝的胞嘧啶脱氨基转变为U，影响也不大，合成出来的绝大多数蛋白质还是具有正常生理功能，而且U作为合成原料经济得多。
第五节重组DNA技术
DNA重组(recombination of DNA)是自然界常见现象，指的是在两个DNA分子之间，或一个DNA分子的两个不同部位之间通过链断裂和片段的交换重接，改变了基因的组合序列。这种交换可发生于同一细胞内或细胞间，甚至不同物种的DNA。DNA重组现象广泛存在于真核细胞、原核细胞乃至病毒和质粒。
本节所要介绍的重组DNA技术或基因工程(genetic engineering)，是70年代由Stanford大学Boyer、Cohen和Berg等科学家建立的一种革命性的技术方法，它是在实验室内用人工方法将不同来源，包括不同种属生物的DNA片段，拼接成一个重组DNA(recombinant DNA)分子，将其引入活细胞内，使其大量复制或表达。这种技术方法称为重组DNA技术。由于它可以把一个生物体中携带的某一特定的遗传信息(基因)，通过一定的方法转移到另一生物体中，使之获得前者的遗传特征，创造新的遗传组合，所以又称为基因工程，若从遗传角度来考虑也可称为遗传工程。重组DNA技术中所含有的目的DNA分子或基因需进行无性繁殖、扩增成为一个克隆(clone)，因此基因工程在不同的场合又可有不同的名称，如分子克隆(molecular cloning)、DNA克隆、基因克隆等。
4．聚合酶链反应(PCR)扩增DNA片段或cDNA
以已有DNA为模板，通过PCR扩增出所需片段。另可以mRNA为模板，采用逆转录酶PCR进行扩增，得到所需要的cDNA。(详见下节)。
(二) 载体
欲将外源基因或DNA片段导入宿主细胞进行扩增或表达，需要通过一个能在宿主细胞中进行自我复制并表达目的基因的载体(vector)的介导，目的DNA与载体在体外构成重组DNA分子，然后导入宿主细胞，进行扩增及表达。以大肠杆菌作为宿主细胞的载体有：质粒、λ噬菌体、粘粒和M13噬菌体等。这些载体分为克隆用和表达用不同种类，有些还含有在真核细胞中生活及基因表达必须的成分，供不同实验目的选用，多数已作为商品供应。
1. 克隆载体(vector of clone)
(1)质粒质粒(plasmid)是细菌染色体外小的双链闭环的DNA分子，能自主复制，并含有抗药性基因。
较理想的质粒应符合下列条件：
1) 要有多个单切口的限制性内切酶的位点，而且外源DNA片段插入后，不影响质粒的复制。
2) 含有抗药性或其他可供筛选的标志，外源DNA插入后，抗药性消失，或其他酶活性丧失。
3) 含有高效的自主复制序列，这样在宿主细胞中质粒复制的拷贝数多。若含有能在真核细胞生活的序列，这种载体则能在真核细胞中生活及表达。pBR322是一种最常用、最基础的质粒。通过人工构建而成，其结构如图12-22所示。大小：4363bp抗药性基因：有两个。氨苄青霉素抗性 (ampicillin resistance,ampR)基因编码β-内酰胺酶(β-1actamase)，能切开氨苄青霉素的内酰胺环，从而使之失效。若在此基因中插入外源DNA片段，即破坏该酶的结构。另一四环素抗性(tetracycline resistance,ampR)基因，编码一种蛋白质，能改变细菌膜的状态，阻止四环素进入细胞而赋予宿主抗四环素的能力。若
该基因被外源DNA插入即失活。自主复制(ori)成分(序列),使pBR322在大肠杆菌内能高效进行复制，产生多拷贝。
另一些质粒如pUC系统，除含ampr基因外，还含大肠杆菌的lacZ基因也常被用作为选择的标记。此基因编码β半乳糖苷酶。LacZ位于多位点接头(polylinker)上。有的还含有高效的启动子。
(2) λ噬菌体λ噬菌体(bacteriophage λ)为线状双链DNA病毒(约50kb)，感染大
肠杆菌。经改造的噬菌体有一、二个EcoRⅠ切点，并含有LacZ基因作为筛选的标志。当中的1/3序列不是病毒生活所必需，可以去除，而由外源DNA片段(5~25kb)替代。如图12-23所示。
β-半乳糖苷酶能分解一种化学品称为5-溴-4-氯-3吲哚-半乳糖苷(5-bromo-4-chloro
-3-indolyl-galactoside，X-gal)，X即为5-bromo-4-chloro-3-indolyl，是一发色(蓝色)基团，当它与半乳糖以糖苷键结合时即为无色。但是X-gal经β-半乳糖苷酶作用后即将X基团释放出来而成蓝色。若LacZ被插入的DNA片段破坏，则不能产生β-半乳糖苷酶，因此在含有X-gal的培养基中成为无色的斑点。若LacZ完整，X-gal被β-半乳糖苷酶分解而成为蓝色的斑点，故可作为筛选的标志。
(3) 其他
2. 表达载体（expression vector）
表达载体是带有调控克隆基因表达必需的转录和翻译信号的克隆载体。克隆基因在细菌和其它细胞中的过量表达，能够产生大量的特异蛋白质。
（1）大肠杆菌表达载体大肠杆菌表达载体（E.coli expression vector）除具有克隆载体所具备的性质以外，还带有控制在大肠杆菌中表达元件即转录和翻译所必需的DNA序列 : 启动子、操纵基因、编码阻遏物的基因、核糖体结合位点、转录终止信号。
（2）真核表达载体真核表达载体（eukaryotic expression vector）含有必不可少的原核序列，如在大肠杆菌中能够作用的复制子，便于挑选带重组质粒细菌的抗生素抗性基因。但在质粒中还包括在真核细胞中生活和表达元件：启动子/ 增强子、克隆位点、终止信号和加poly(A) 信号、剪接供体和受体、复制起始点和选择标记基因。
(三) 工具酶
限制性内切酶(restriction enzyme或restriction endonuclease)，DNA连接酶、末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT)、逆转录酶、S1核酸酶(切单链DNA或RNA)、碱性磷酸酶等均属工具酶。限制性内切酶是重组DNA技术中最关键的工具酶，现着重加以介绍。
限制性内切酶是微生物的一种自我保护的酶，它能识别双链DNA分子中特异碱基序列并切开。所以当外源DNA侵入细菌体时，细菌体为保护自身DNA的完整性，通过其所含的特有的限制性内切酶对外源DNA进行酶解，而自身的DNA分子中所含该限制性内切酶的识别碱基序列则被另一种酶进行甲基化而保护起来，故不被自己的限制性内切酶所切断。
限制性内切酶识别的DNA序列多数为4~6个碱基，新近发现一些能识别8个碱基的。识别碱基数少的酶对DNA切的机率多，碱基数大则少。所以识别8个碱基序列的酶，可用于分析大片段DNA，可切成上百乃至上千kb的片段。限制性内切酶的识别序列都具有回文或双重对称结构的特点。
切口：有两种切口。一种切开后，即成黏性末端(cohesive ends或sticky ends)，因为两个末端的碱基互补配对，易通过氢键相连。
有些限制性内切酶的切口，成为平头末端(blunt ends)
不同的DNA分子上若有某一种限制性内切酶的位点，均能被该酶切断，并产生相同的切口，这对重组DNA分子很有利。
拼接方法：
1. 黏性末端
2．均聚体尾部 (homopolymeric tailing)
3．化学合成的接头 (chemical synthetic linker)
三、重组DNA分子引入宿主细胞
(一) 原核细胞
最常用的是大肠杆菌，要选择合适的菌株(strain)。宿主细胞先经氯化钙处理，以改变细胞膜的通透性，使重组DNA分子容易进入。这种将重组质粒DNA分子引入细菌，使其在细菌体内扩增及表达的过程称为转化 (transformation)。
(二) 动物细胞
宿主细胞主动摄取或被动引入外源DNA片段或重组DNA分子的过程称为转染(transfection)。进入细胞内的DNA可以被整合至宿主的基因组中，也可以在染色体外生活表达，这就需要采用含有能在真核细胞生活的结构成分的载体。可用磷酸钙介导(calcium-phosphate mediated)使外源DNA形成沉淀颗粒，颗粒若沉着在动物细胞的表面，以利细胞将这些颗粒摄入。近年用脂质体(1iposome)介导外源DNA的转移，可提高转染效率。用电穿孔(electroporation)方法，将外源DNA与宿主细胞放入特别的装置内，在高压电脉冲作用下，细胞外的DNA分子会在细胞膜上穿孔而入，并最终进入细胞核内，整合至宿主基因组中。用基因枪（颗粒轰击particle bombardment）方法是将外源DNA包裹了化学性质稳定的金或钨微粒以后，在电子发射装置或高压气流的驱动下，以极高速度打入受体细胞，组织和器官中，以进行基因转移技术。
用逆转录病毒(retrovirus)作为载体可以成功地感染动物细胞。另外可用微注射(microinjection)的方法，将外源DNA分子直接注射入细胞内或核内。近年发展一种转基因(transgenic)小鼠方法，即将重组DNA分子注射于单细胞受精卵的原核内，然后再将其植入一假妊娠母鼠的子宫内。生下的小鼠在全身各组织细胞的基因组DNA中都含有这种外源DNA，可以研究在整体条件下外源DNA的功能。

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