荧光PCR时ct值大于30?现在在做荧光pcr,细胞的,12孔板,但是进行扩增时发现ct值大于30,一般在35左右,之后将循环数设置为60,才能见到完美的曲线,请教大家分析下出现的原因,附上溶解曲线和扩增
来源：学生作业帮助网 编辑：六六作业网 时间：2024/12/23 22:35:28
荧光PCR时ct值大于30?现在在做荧光pcr,细胞的,12孔板,但是进行扩增时发现ct值大于30,一般在35左右,之后将循环数设置为60,才能见到完美的曲线,请教大家分析下出现的原因,附上溶解曲线和扩增
荧光PCR时ct值大于30?
现在在做荧光pcr,细胞的,12孔板,但是进行扩增时发现ct值大于30,一般在35左右,之后将循环数设置为60,才能见到完美的曲线,请教大家分析下出现的原因,附上溶解曲线和扩增曲线,我的猜测是cdna含量太低导致的,引物设计使用primer 6.0 长度在200bp.
其余 图片请大家移步 我的空间 这儿只能插入一张
逆转录体系是20ul,rna加入量是1ug,cdna加入量是5ul,没有进行稀释,使用toyobo试剂盒,之前进行过阴性实验,无二聚体形成,引物设计使用primer6.
荧光PCR时ct值大于30?现在在做荧光pcr,细胞的,12孔板,但是进行扩增时发现ct值大于30,一般在35左右,之后将循环数设置为60,才能见到完美的曲线,请教大家分析下出现的原因,附上溶解曲线和扩增
看了你空间里的溶解曲线,你可以看到溶解峰的温度都很低,全在80以下,你扩出来的东西多半只是引物,你跑定量的时候有做NTC的孔吗,如果有做,可以对照NTC组和加了模板的组,溶解峰还是一样的话,那你扩出来的产物100%是引物了.
再有,你的扩增曲线问题,CT太了,一般做定量认为CT=25时,是一个模板扩出来的,所以当大于25扩出来的结果都不可信.
还有,你反转录的时候RNA加多少,2微克?,反转录体系是多少,20微升?反转录之后按照多少比例稀释,1比4?
总之,问题可以再问详细一点,也可以直接HI我
如果做过NTC那溶解峰就没问题了,而且都很单一,特异性蛮好的.没稀释的cDNA做的定量,CT大于30?你P的什么基因呢,表达量也太低了吧,内参的CT呢,也是这么低吗