高效液相色谱纯化蛋白质一般都用什么柱子啊?

高效液相色谱纯化蛋白质一般都用什么柱子啊?
高效液相色谱纯化蛋白质一般都用什么柱子啊?

高效液相色谱纯化蛋白质一般都用什么柱子啊?
色谱柱在HPLC中是非常关键的部件.一台色谱仪如果没有色谱柱几乎什么工作也做不了.色谱柱是消耗品,有一定寿命,使用中也非常容易出问题.普通的正相反相色谱柱使用得当可用一、两年.使用不得当用两、三个月就可能损坏.所以使用中应该非常注意.
1.
在使用一根新的色谱柱之前,一定要看柱说明书,将柱子的使用压力、pH值、温度范围和所用流动相种类都要弄清楚.接触最多的是C18色谱柱,它对试剂应用的范围非常广,甲醇、水、乙腈、四氢呋喃、三氯甲烷、正乙烷、各种缓冲盐都适用.但其他的色谱柱所使用的试剂就有一定的要求,有的色谱柱只能使用水,不能使用有机试剂,有的色谱柱只能使用有机试剂,而且使用指定是某一种,象GPC色谱柱.这些事情一定搞清楚,如果流动相使用不对,柱子很快会损坏.另外在更换柱子时不能让不能使用的流动相进入柱子.
2.
柱子是有方向的,柱子上箭头的方向就是流动相流动的方向.当换新柱子时,不要马上就接到检测器上使用.将柱子入口处接在进样器的出口,柱子出口处（即箭头的一端）先不接检测器,按箭头方向垂直朝上,用流动相（甲醇）以1ml/min的流速冲洗1min左右.将柱子里的小气泡全部赶走以后再接到检测器上,否则小气泡跑到检测池里,就很难赶走,检测器产生噪声信号,基线也就走不好.
3.
关于压力对色谱柱的影响：常用的正反两相色谱柱一般耐压在12～20MPa之间,生产厂家不同,耐压也不同,从理论上讲耐压高的色谱柱柱效就高,但柱效高低不仅与耐压的高低有关,还有其他因素.从使用中看,在保证柱效的同时,耐压不要太高,仪器所显示的压力是流路、混合器、自动进样器、柱压、流通池总体的压力,检查柱压力应分段检查.压力过高不仅柱子受不了,其他的部件也会出问题,例如自动进样器.
4.
色谱柱对pH值是有一定的使用范围.以硅胶为担体的柱子一般使用范围在2～7pH.
耐碱性能不太好,流动相的pH大于8会使硅胶溶解.有些分析条件须用碱性流动相,这时一定要选耐碱性好的色谱柱,流动相的PH值过高或过低,流动相使用纯水,使用高浓度磷酸盐缓冲溶液,使用离子对试剂等,均可能造成色谱柱填料被化学破坏,这种对色谱柱固定相及键合相的破坏通常是不可修复的.
5.
色谱柱的使用温度不要超过说明书上规定的温度.一般使用温度在60℃以下,典型硅胶基质色谱柱的使用温度在5℃与60℃之间,高温使用会缩短柱寿命.
6.
色谱柱使用过程中压力的骤然波动,温度的骤然变化或机械撞击都会对色谱柱床产生影响.进样过程中,进样阀转动太慢引起压力波动；流速的突然增大都应在日常分析中尽量避免.一般说来,在低柱压下操作可大大减少由压力波动造成的柱效损失.这种问题是不可修复的
7.
色谱柱内存在缓冲盐时,如果用高浓度甲醇或其他有机溶剂冲洗色谱柱,会导致柱内缓冲盐结晶析出,造成柱压明显升高.出现该问题时,反相色谱柱首先应使用20%左右有机溶剂的水溶液低流速冲洗色谱柱,使柱内的盐全部溶解冲出,再换成高浓度甲醇或其他有机溶剂的流动相.
8.
样品的预处理,许多样品,特别是生物样品与中药材,其组分复杂,样品预处理是影响色谱柱寿命的关键.样品经过常规的前处理后,进样前还需进行以下步骤：a.用微孔过滤膜出除去样品中的不溶颗粒,以免赌塞柱头筛板及柱内填充床,使柱压升高.b.将样品用流动相溶解或用与流动相互溶的溶剂溶解.
9.
为了保护色谱柱,在色谱柱前接了一个保护柱.保护柱通常是比较短的分析柱,通过吸附可能污染分析柱的强保留杂质,达到保护色谱柱的目的.保护柱的筛板与在线过滤器一样可以阻挡微粒杂质.为了达到最好的保护效果同时避免导致色谱结果的改变,最好选用与分析柱相同或相似的填料填充保护柱.
10.
色谱柱用合适的溶剂保存,若为C18柱推荐用甲醇保存.在日常分析中,流动相含有的不纯物质和样品中的某些组分会吸附在色谱柱中,随着分析时间的延长,吸附量会越多,所以柱子要经常清洗,一般柱子使用一两个星期洗一次,柱子不同清洗的流动相就不同,C18柱子常用甲醇清洗,不要用水清洗这对柱子不好,一般清洗3～4小时,另外色谱柱长时间不用,存放时要将柱子洗干净,脏柱子放置时间越长,柱效会大大降低.存放时,柱内应充满溶剂（甲醇或乙腈）,两端封死.
近几年化验室用的液相色谱仪是越来越多,所用色谱柱的种类也越来越多,问题出的也较多,值得注意的是,不论怎样对色谱柱进行处理,一般都很难恢复到原有水平,因此,大家再使用色谱柱之前一定要看说明书,把以上几项问题搞清楚后再使用,尽量避免发生如上问题.