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中文如下：
RevertAid™第一链cDNA合成试剂盒
(#K1621 10次)
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分析许可证
警示
推荐第一链cDNA合成在RNAase污染被清除的条件下操作.移液器枪头和试管必须用0.1%的DEPC处理（0.1%水溶液浸泡过夜,100℃加热30min,高压灭菌）.强烈推荐戴手套.
重要!
-20℃保存.
（如果长期保存对照RNA置-70℃）.
对照RNA避免反复冻融.对照RNA融化后冰上操作.
Lot.:1210
保质期见包装标签.
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试剂盒设计用来从RNA模板制备全长第一链cDNA.RevertAid™第一链cDNA合成试剂盒依赖于一种遗传工程产品：低RNA酶H活性的Moloney鼠白血病病毒逆转录酶（RevertAid™ M-MuLV RT）.这就允许从长模板（最大13 kb）合成全长cDNA.RevertAid™ M-MuLV RT合成第一链cDNA的位置由不同引物决定：
• 随机六聚物引物：在RNA模板上非特异的位置,总RNA中所有RNA都是cDNA合成的模板.
• oligo(dT)18：在poly(A)+ mRNA 的3’-末端.这种情况下,只有带3’-poly(A)尾的mRNA是cDNA合成的模板.
• 序列特异性引物：在引物结合位置.
用这个系统合成的第一链cDNA可用做PCR*模板.因为cDNA合成和PCR的反应条件是一致的,所以cDNA反应混合物可直接加入PCR混合物. 合成的第一链cDNA也可用做第二链合成的模板.放射标记的DNA 可用做杂交探针.
带3’-poly(A)尾的1.1 kb RNA 作为对照.
*PCR过程为Hoffmann-La Roche, Inc.的专利涵盖.
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试剂盒内容
1. RevertAid™ M-MuLV逆转录酶 (200u*/µl)：
15µl酶溶解在贮存缓冲液中：50mM Tris-HCl (pH 8.3), 0.1M NaCl, 1mM EDTA, 5mM DTT, 0.1% Triton® X-100和50%甘油.
2. RiboLock™ 核糖核酸酶抑制剂（20u**/µl）：
15µl酶溶解在贮存缓冲液中：20mM HEPES-NaOH (pH 7.5), 50mM NaCl, 8mM DTT, 0.5mM ELUGENT®洗涤剂和50%甘油.
3. 5x反应缓冲液：
100µl 5x反应缓冲液：250mM Tris-HCl (pH 8.3 at 25°C), 250mM KCl, 20mM MgCl2, 50mM DTT.
4. 10mM dNTP混合物：
30µl 10mM dGTP、dATP、dTTP、dCTP水溶液.
5. Oligo(dT)18引物：
15µl 0.5µg/µl (15A260 units/ml) 水溶液.
6. 随机六聚物引物：
15µl 0.2µg/µl (6A260 units/ml) 水溶液.
7. 对照引物：
15µl 10pmol/µl (1.7A260 units/ml) 17-mer水溶液.
8. 对照RNA：
15µl 1.1 kb带3’-poly(A)尾的1.1 kb RNA ,0.5µg/µl.
9. DEPC处理过的水：
2 x 1.5ml 水在deionized on a Milli-Q®装置中去离子,DEPC处理.
* 一个单位 RevertAid™ M-MuLV RT：37°C 10min内将 1 nmole dTMP结合到一个多核苷酸片段上（DE-81中吸附）.
**一个单位 RiboLock™核糖核酸酶抑制剂：抑制5ng RNase A 50%的活性.
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操作过程
1. 合成适合PCR 扩增的第一链cDNA
① 冰上在一个管子中制备如下反应混合物：
模板RNA*：
总RNA 0.1-5μg
或poly(A)+ RNA 10ng- 0.5μg
或特异RNA 0.01pg - 0.5μg
引物：
oligo(dT)18引物(0.5μg/μl) 1μl
或随机六聚物引物(0.2μg/μl) 1μl
或序列特异性引物 15–20pmol
DEPC处理过的水 to 12μl
轻柔混合,微量离心机离心3-5秒.
② 70°C孵育混合物5min,冰冷却,短暂离心,收集沉淀.
③ 管子置于冰上,按指定顺序加入以下成份：
5x 反应缓冲液 4μl
RiboLock™核糖核酸酶抑制剂(20u/μl) 1μl
10mM dNTP混合物 2μl
轻柔混合,短暂离心,收集沉淀.
④ 37°C孵育5min（随机六聚物引物25°C 5min）.
*反应所需的总RNA或poly(A)+ RNA的量决定于基因的表达水平.
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⑤ 加入RevertAid™ M-MuLV 逆转录酶 (200u/μl) 1μl.
终体积20μl.
⑥ 42°C孵育混合物60min （随机六聚物引物25°C孵育10min,最后42°C 60min）.
⑦ 70°C 加热10min终止反应.冰冷却.
合成的第一链cDNA可直接用于PCR扩增.PCR 可用以下产品来完成：
Taq DNA聚合酶（推荐）（#EP0401, #EP0402, #EP0403, #EP0404）；
Taq DNA聚合酶（天然的,没有BSA）（#EP0281, #EP0282, #EP0283, #EP0284）;
Taq DNA聚合酶（天然的,没有BSA）（#EP0071, #EP0072）；
2mM dNTP 混合物（#R0241, #R0242）；
10mM dNTP 混合物（#R0191, #R0192）.
注意：
1. 先从总RNA 中分离poly(A)+ RNA并不是一定需要的,但这样做可以改善终产物的收获率和纯度.
2. RNA 样品不能被基因组DNA污染.
3. oligo(dT)18引物不需要优化条件,而以反应中合成的cDNA平均长度来看,随机六聚物引物与RNA的比例是严格的.增加hexamer/RNA比例将导致更短的(~500 bp) cDNA更高的得率,反之降低这个比例将产生更长的产物.
4. 增加反应温度到45°C可减轻富含GC mRNA的二级结构问题.
5. 分析反应产物(see chapter 4) cDNA 需要[32P]放射标记.为此加入RevertAid™ M-MuLV RT前加入10μCi[-32P]dNTP (e.g., dATP) 到反应混合物中.加入1μl 0.5M EDTA 终止反应,置于冰上.
6. 合成的cDNA应该-20°C保存.
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2.合成适合第二链合成的第一链cDNA
① 冰上在一个管子中制备如下反应混合物：
模板RNA*：
poly(A)+ RNA 1μg
或特异RNA 0.5 - 1μg
引物：
oligo(dT)18引物(0.5μg/μl) 1μl
或随机六聚物引物(0.2μg/μl) 1μl
或序列特异性引物 100pmol
DEPC处理过的水 to 12μl
轻柔混合,微量离心机离心3-5秒.
② 70°C孵育混合物5min,冰冷却,短暂离心,收集沉淀.
③ 管子置于冰上,按指定顺序加入以下成份：
5x 反应缓冲液 4μl
RiboLock™核糖核酸酶抑制剂(20u/μl) 1μl
10mM dNTP混合物 2μl
轻柔混合,短暂离心,收集沉淀.
④ 37°C孵育5min（随机六聚物引物25°C 5min）.
⑤ 加入RevertAid™ M-MuLV 逆转录酶 (200u/μl) 1μl.
终体积20μl.
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⑥ 42°C孵育混合物60min （随机六聚物引物25°C孵育10min,最后42°C 60min）.
⑦ 70°C 加热10min终止反应.冰冷却.
合成的第一链cDNA可用于第二链合成.合成可用以下产品来完成：
DNA聚合酶I (#EP0041, #EP0042);
T4 DNA连结酶(#EL0014, #EL0011, #EL0012);
核糖核酸酶H (#EN0201, #EN0202);
核酸酶S1 (#EN0321).
Notes
1. 为了增加合成的特异性和效率必须从总细胞RNA中分离poly(A)+ 片段.
2. oligo(dT)18引物不需要优化条件,而以反应中合成的cDNA平均长度来看,随机六聚物引物与RNA的比例是严格的.增加hexamer/RNA比例将导致更短的(~500 bp) cDNA更高的得率,反之降低这个比例将产生更长的产物.
3. 增加反应温度到45°C可减轻富含GC mRNA的二级结构问题.
4. 分析反应产物(see chapter 4) cDNA 需要[32P]放射标记.为此加入RevertAid™ M-MuLV RT前加入10μCi[-32P]dNTP (e.g., dATP) 到反应混合物中.加入1μl 0.5M EDTA 终止反应,置于冰上.
5. 合成的cDNA应该-20°C保存..
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3. 合成高比放射性的第一链
① 冰上在一个管子中制备如下反应混合物：
模板RNA*：
poly(A)+ RNA 0.5μg
引物：
oligo(dT)18引物(0.5μg/μl) 1μl
或随机六聚物引物(0.2μg/μl) 1.5μl
或序列特异性引物 100pmol
DEPC处理过的水 to 8μl
轻柔混合,微量离心机离心3-5秒.
② 70°C孵育混合物5min,冰冷却,短暂离心,收集沉淀.
③ 管子置于冰上,按指定顺序加入以下成份：
5x 反应缓冲液 4μl
RiboLock™核糖核酸酶抑制剂(20u/μl) 1μl
10mM dGTP, dCTP, dTTP混合物 1μl
0.1mM dATP* 4μl
轻柔混合,短暂离心,收集沉淀.
④ 37°C孵育5min（随机六聚物引物25°C 5min）.
⑤ 加入：
[-32P]dATP (10mCi/ml) 1μl
RevertAid™ M-MuLV 逆转录酶 (200u/μl) 1μl
终体积20μl.
* 个别的dNTP溶液不包括在这个试剂盒内.使用dNTP Set (#R0181)进行合成..
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⑥ 42°C孵育混合物60min （随机六聚物引物25°C孵育10min,最后42°C 60min）.
⑦ 加入5μl 0.5M EDTA终止反应.
⑧ 如果需要,加入等体积(25μl)0.6N NaOH水解RNA,70°C孵育30min.
⑨ 在Sephadex® G-50柱上层析法移除未结合dNTPs.
用这种方法获得的高特异活性第一链cDNA (>107 dpm/μg)可用做Southern中的杂交探针.
注意：
为了获得更高特异活性 (over 108dpm/μg) 的cDNA,加入100μCi of [-32P]dATP到反应混合物中.如果最终的反应体系大于20μl,在分离管中真空蒸发10μl [-32P]dATP (10mCi/ml)并转移制备的反应混合物到这个管子中 (5 step).然后继续合成.
4. 分析第一链cDNA产物
仅放射标记的cDNA产物可以用碱性琼脂糖凝胶电泳鉴定或分析.
测定第一链cDNA的得率
① 点1μl样品到两张DE-81滤膜(1.5x1.5cm).
② 烤灯烤干滤膜.保留一张滤膜,直接用于测定样品总放射活性.
③ 另一张滤膜在10ml 7.5% (w/v)Na2HPO4 x12H2O中洗涤三次5min；水漂洗,丙酮或96%乙醇洗.
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④ 烤灯烤干洗过的滤膜.
⑤ 转移两张滤膜（未洗和已洗的）到放射活性计数器内并计数.
⑥ 用以下公式计算第一链cDNA得率：
如果dNTP终浓度是1.0mM,那么测定(20μl)中mol dATP是2x10-8 mol.标记的dATP数量是相当低的,所以可忽略.然而,在高特异活性的cDNA时(chapter 3),未标记dATP的终浓度是0.02mM.为了测量中mol dATP的计算,需要总计未标记和标记的摩尔数.
MW 是核酸的平均分子量,等于333x106 μg/mol.因为所有四种dNTP都参加反应,所以MW 乘了4.
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例如：For example:
如果水洗滤膜产生4x104dpm,未水洗滤膜产生1.8x106dpm；
那么：
cDNA yield (μg) = 4x104dpm x (2x10-8mol dATP) x 4 x (333x106μg/mol) = 0.59μg
1.8x106dpm
cDNA yield % = 0.59μg x 100% = 59%
1μg
碱性琼脂糖凝胶电泳分析
标记[32P] 的第一链cDNA合成产物可以用碱性琼脂糖凝胶电泳分析.同样,合成产物和所用的DNA marker 都要[32P]标记.
① 制备1.4% 琼脂糖凝胶（30mM NaCl, 2mM EDTA）,在碱性电泳缓冲液(30mM NaOH, 2mM EDTA)平衡至少1h.
② 标本抽样(1x105 dpm),转移到一个单独的管子中,5μl水稀释.加入5μl 2x loading buffer
(60mM NaOH, 2mM EDTA, 6% Ficoll® 400, 0.05% bromophenol blue).标记的DNA marker应该用同样的2xloading buffer稀释.
注意. 2x loading buffer应该保存在-20°C,或染料应该使用前才加.
③ 加入样品,在碱性琼脂糖凝胶中5V/cm电泳,到染料泳动到接近凝胶2/3的位置处中止.
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④ 凝胶浸没在7% 三氯醋酸 (TCA)中,室温30min.
⑤ 干胶器上真空干燥凝胶,或玻璃板加压的多层纸巾下干燥1-2 hours.
⑥ 干燥的凝胶覆盖在塑料封皮下,室温X-ray胶片室温暴光过夜.
对照的合成
提供带3’-poly(A)尾的1.1 kb RNA 作为对照.
① 冰上在一个管子中制备如下反应混合物：
模板RNA*：
对照 RNA 0.5μg
引物：
oligo(dT)18引物(0.5μg/μl) 1μl
或随机六聚物引物(0.2μg/μl) 1μl
或对照（序列特异性）引物(10pmol) 2μl
DEPC处理过的水 to 11μl
轻柔混合,微量离心机离心3-5秒.
② 70°C孵育混合物5min,冰冷却,短暂离心,收集沉淀.
③ 管子置于冰上,按指定顺序加入以下成份：
5x 反应缓冲液 4μl
10mM dNTP 混合物 2μl
RiboLock™核糖核酸酶抑制剂(20u/μl) 1μl
轻柔混合,短暂离心,收集沉淀.
④ 37°C孵育5min（随机六聚物引物25°C 5min）.
⑤ 加入：
[-32P]dATP (10mCi/ml) 1μl
RevertAid™ M-MuLV 逆转录酶 (200u/μl) 1μl
终体积20μl.
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⑥ 42°C孵育混合物60min （随机六聚物引物25°C孵育10min,最后42°C 60min）.
⑦ 加入1μl 0.5M EDTA终止反应,置于冰上.
⑧ 分析产物(see chapter 4).
注意：
1. 使用对照RNA时第一链cDNA的得率常大于50%.
2. 如果用oligo(dT)18或对照（序列特异性）引物合成对照– 可以观察到一个清楚的1.1 kb 条带.如果用随机六聚物引物,通常可观察到几个短的条带.
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常见问题
低得率、没有可检测到的产物是逆转录酶反应失败的两个清楚标志.
可能原因 检查 补救
DNA模板降解. 用乙二醛、甲醛凝胶电泳检查RNA模板完整性.对照RNA在凝胶中应该可见一条明亮的1.1kb带. 操作样品RNA时,要小心不要被RNases污染.-70°C保存模板RNA和对照RNA,避免避免反复冻融样品,融化后置于冰上.
RNase污染反应 混合物. 使用对照并分析所得产物(见对照的合成). 无菌状态下制备反应混合物,始终戴手套,用DEPC 处理所有接触样品的器皿.主要不要污染溶液.
RevertAid™ M-MuLV逆转录酶抑制剂(SDS, EDTA, 胍盐, 磷酸盐, 焦磷酸盐, 多胺, 精胺, 精脒). 在RNA样品中混入1μg对照RNA,同时合成.如果用oligo(dT)18或对照引物,合成的得率应该大于50%,可见到一明亮的1.1kb附加条带. 96%乙醇沉淀RNA样品,75%乙醇洗涤 (制备乙醇溶液应使用DEPC处理过的水). 不要加抑制剂到反应混合物中.
不适当的引物 用其他的引物进行,分析产物. 序列特异性引物应该与RNA 3’-末端互补.如果If the RNA模板包含转录间歇,使用随机六聚物引物合成.
合成的第一链cDNA序列错误. 重复合成cDNA.
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质量控制
试剂盒的所有试剂都通过用一个多腺苷酸RNA转录本作为对照模板(特异的对照引物、oligo(dT)18、随机六聚物引物)进行第一链cDNA合成反应来检测..
质量核定: Birute Gagiliene