pcr技术扩增
来源：学生作业帮助网 编辑：六六作业网 时间：2024/11/15 13:43:09
pcr技术扩增
pcr技术扩增
pcr技术扩增
PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95度时解旋,55度时引物与单链按碱基互补配对的原则结合,再调温度至72度左右DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链.由PCR技术制造的PCR仪实际就是一个温控设备,能在95度,55度,72度之间很好的进行控制.
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物.PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基互补配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链,重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板.每完成一个循环需2～4分钟,3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍.
PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即：
引物(PCR引物为DNA片段,细胞内DNA复制的引物为一段RNA链）、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）.
PCR相关技术
一.锚定PCR(anchored PCR)：
•引进锚定引物,可以帮助克服序列未知或序列未全知的障碍.
•在DNA3’-末端加上poly(dG)尾,与此相对应的锚定引物poly(dC)一般应在十二聚以上.
二.不对称PCR(asymmetric PCR)
不对称PCR主要是在PCR体系中设计不同的引物浓度,两条引物浓度比为1：50或1：100,前12个循环两条模板等量扩增,之后低浓度引物消耗殆尽,其扩增产物减少以至于无；而高浓度引物介导产生的扩增产物（即单链DNA）逐渐增加,可得到大量单链DNA（ssDNA）用于直接测序.
三.反向PCR(inverse PCR)
反向PCR用于扩增已知DNA片段两侧的未知序列.
四.多重PCR(multiplex PCR)
多重PCR是用多对引物同时对模板DNA上的多个区域进行扩增.
多重PCR技术的难点不是在于其原理和操作的复杂性,而是在于其多对引物的设计,必需保证多对引物之间不形成引物二聚体,引物与目标模板区域具有高度特异性.
应用于基因诊断,对与疾病相关的基因（庞大）进行扩增检测.
五.逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)
•由mRNA逆转录产生cDNA链作为PCR反应模板.
•逆转录合成cDNA时,引物可选用特异引物、随机六聚体引物或寡聚dT(12-18).
•设计RT-PCR的引物时最好是分散在不同的外显子上,以免基因组DNA的污染导致假阳性结果
在高温下，用限制酶切下目的基因，使之成为游离的核苷酸，再用DNA连接酶使之再次成为墓地基因（复制的），由于目的基因较多所以呈几何倍增