为什么要先构建克隆载体再用表达载体
来源：学生作业帮助网 编辑：六六作业网 时间：2024/12/24 03:17:25
为什么要先构建克隆载体再用表达载体
为什么要先构建克隆载体再用表达载体
为什么要先构建克隆载体再用表达载体
构建克隆载体是大量扩增DNA片段,用以测序、酶切和改造等对DNA实施的后续操作,构建表达载体是大量得到翻译产物——蛋白质.
为什么要先构建克隆载体,再用表达载体,我猜是因为：
①得到大量的DNA,虽然PCR也可以,但PCR扩增有出错率、但你每做一次常规的PCR,而且每次都要重新提DNA和RNA才行,而且,PCR反应的试剂盒又不便宜,用PCR来制备大量DNA有点得不偿失.尽管构建克隆载体也存在操作复杂（相对于PCR）,成功率不是极高,而且还要筛选,但一旦你重组成功并转入了大肠杆菌,你就可以保存了,你想什么时候用,摇个菌,就可以制备到大量的DNA.
②测序需要.你想转表达,你首先得确定你扩增的目的片段是不是你要的,不要以为你设计了个特异性引物,然后跟你mark的长度就可以确定了,这也只是推测,在科学上不严谨.扩增出的基因片段保险起见或者经费允许,要拿去测序,而一般送测的序列都是构建到载体上的序列,克隆载体上一般也都带有测序引物,已确定这就是你要的那条序列.你要写论文必须要给人真凭实据.
这样才能选取合适的克隆载体，提高克隆效率，增大表达量，从而高效的得到所需的表达产物。
先构建克隆载体再构建表达载体并不是一个必须的选择，如果你的扩增PCR目的条带很亮，而且单一性很好，我建议你可以直接克隆进入表达载体。
很多人选择先构建克隆载体，是因为在扩增基因时目的条带模糊，特异性不好，这样将基因连接到克隆载体上就可以便于挑去单克隆进行测序，增加测序的准确度，从而确认自己克隆基因序列的正确性。单纯的PCR产物往往是一些各种PCR片段的混合物，直接送过去测序，往往导致测序信...
全部展开
先构建克隆载体再构建表达载体并不是一个必须的选择，如果你的扩增PCR目的条带很亮，而且单一性很好，我建议你可以直接克隆进入表达载体。
很多人选择先构建克隆载体，是因为在扩增基因时目的条带模糊，特异性不好，这样将基因连接到克隆载体上就可以便于挑去单克隆进行测序，增加测序的准确度，从而确认自己克隆基因序列的正确性。单纯的PCR产物往往是一些各种PCR片段的混合物，直接送过去测序，往往导致测序信号峰很杂，有时候并不能测出想要的信号序列。同时保存的PCR片段比较容易降解，而构建好克隆载体后形成的质粒是很容易扩增和保存的。
先构建克隆载体，一是为了便于测序，确认克隆序列正确，二是为了便于基因PCR片段的保存。
收起
你最早的目的基因、质粒什么的都是拿去公司合成的，很少量，所以要先克隆，把它变多，再做实验，去表达