玉米幼苗测可溶性糖的蒽酮硫酸法

玉米幼苗测可溶性糖的蒽酮硫酸法
玉米幼苗测可溶性糖的蒽酮硫酸法

玉米幼苗测可溶性糖的蒽酮硫酸法
植物体内的碳素营养状况以及农产品的品质性状,常以可溶性糖和淀粉的含量作为重要指标,本实验学习几种定量测定可溶性糖和淀粉的方法.
（一）苯酚法测定可溶性糖
【实验原理】
植物体内的可溶性糖主要是指能溶于水及乙醇的单糖和寡聚糖.苯酚法测定可溶性糖的原理是：糖在浓硫酸作用下,脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物,在10－100mg范围内其颜色深浅与糖的含量成正比,且在485nm波长下有最大吸收峰,故可用比色法在此波长下测定.苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定,方法简单,灵敏度高,实验时基本不受蛋白质存在的影响,并且产生的颜色稳定160min以上.
【实验仪器及试剂】
1．仪器：分光光度计、电炉、铝锅、20mL刻度试管、刻度吸管、记号笔、吸水纸适量.
2．试剂：
（1）90％苯酚溶液：称取90g苯酚（AR）,加蒸馏水10mL溶解,在室温下可保存数月.
（2）9％苯酚溶液：取3mL 90％苯酚溶液,加蒸馏水至30mL,现配现用.
（3）浓硫酸（比重1.84）.
（4）1％蔗糖标准液：将分析纯蔗糖在80℃下烘至恒重,精确称取1.000g.加少量水溶解,移入100mL容量瓶中,加入0.5mL浓硫酸,用蒸馏水定容至刻度.
（5）100ug/L蔗糖标准液：精确吸取1％蔗糖标准液1mL加入100mL容量瓶中,加水定容.
【实验步骤】
1．标准曲线的制作：取20mL刻度试管11支,从0－10分别编号,按表27－1加入溶液和水,然后按顺序向试管内加入1mL 9％苯酚溶液,摇匀,再从管液正面以 5－20s.加入5 mL浓硫酸,摇匀.比色液总体积为8 mL,在恒温下放置30min.显色.然后以空白为参比,在485nm波长下比色测定,以糖含量为横坐标,光密度为纵坐标,绘制标准曲线,求出标准直线方程.
2．可溶性糖的提取 取新鲜植物叶片,擦净表面污物,剪碎混匀,称取0.10－0.30g,共3份,分别放入3支刻度试管中,加入5-10mL 蒸馏水,塑料薄膜封口,于沸水中提取30min（提取2次）,提取液过滤入25mL容量瓶中,反复冲洗试管及残渣,定容至刻度.
3．测定吸取0.5mL样品液于试管中（重复2次）,加蒸馏水1.5mL,同制作标准曲线的步骤,按顺序分别加入苯酚、浓硫酸溶液,显色并测定光密度.由标准线性方程求出糖的量,按下式计算测试样品中糖含量.
式中：C一标准方程求得糖量（ug）
α一吸取样品液体积（mL）
V－提取液量（mL）
n一稀释倍数
W一组织重量（g）
（二） 蒽酮法测定可溶性糖
【实验原理】
糖在浓硫酸作用下,可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛,生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物,在一定范围内,颜色的深浅与糖的含量成正比,故可用于糖的定量.
该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物,不但可以测定戊糖与己糖,而且可以测所有寡糖类和多糖类,其中包括淀粉、纤维素等（因为反应液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖而发生反应X 所以用愈酮法测出的碳水化合物含量,实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量.在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下,用意酮法可以一次测出总量,省去许多麻烦,因此,有特殊的应用价值.但在测定水溶性碳水化合物时,则应注意切勿将样品的未溶解残渣加入反应液中,不然会因为细胞壁中的纤维素、半纤维素等与意酮试剂发生反应而增加了测定误差.此外,不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同,果糖显色最深,葡萄糖次之,半乳糖、甘露糖较浅,五碳糖显色更浅,故测定糖的混合物时,常因不同糖类的比例不同造成误差,但测定单一糖类时,则可避免此种误差.
糖类与蒽酮反应生成的有色物质在可见光区的吸收峰为630nm,故在此波长下进行比色.
【实验仪器及试剂】
1．仪器：分光光度计、电炉、铝锅、20ml刻度试管、刻度吸管、记号笔、吸水纸适量.
2．试剂：
（1）蒽酮乙酸乙酯试剂：取分析纯蒽酮1g,溶于50mL乙酸乙酯中,贮于棕色瓶中,在黑暗中可保存数周,如有结晶析出,可微热溶解.
（2）浓硫酸（比重1.84）
【实验步骤】
1．标准曲线的制作：按方法一标准曲线的制作方法加入标准的蔗糖溶液,然后按顺序向试管中加入0.5mL蒽酮乙酸乙酯试剂和5mL浓硫酸,充分振荡,立即将试管放入沸水浴中,逐管准确保温1min取出后自然冷却至室温,以空白作参比,在630nm波长下测其光密度,以光密度为纵坐标,以糖含量为横坐标,绘制标准曲线,并求出标准线性方程.
2．可溶性糖的提取同方法一第二步.
3．显色测定：吸取样品提取液0.5mL于20mL刻度试管中（重复2次）,加蒸馏水1.5mL,以下步骤与标准曲线测定相同,测定样品的光密度.
4．计算可溶性糖的含量,计算公式同方法一.
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