请教梯度PCR设置梯度问题请问：梯度PCR在变性、退火及延伸三步均可设置梯度,那么如果在摸条件时三步均设置梯度,是否有N*M*K（N、M、K分别代表三步的条件数）种组合?如果是,那在仪器里如
来源：学生作业帮助网 编辑：六六作业网 时间：2024/11/24 17:52:49
请教梯度PCR设置梯度问题请问：梯度PCR在变性、退火及延伸三步均可设置梯度,那么如果在摸条件时三步均设置梯度,是否有N*M*K（N、M、K分别代表三步的条件数）种组合?如果是,那在仪器里如
请教梯度PCR设置梯度问题
请问：梯度PCR在变性、退火及延伸三步均可设置梯度,那么如果在摸条件时三步均设置梯度,是否有N*M*K（N、M、K分别代表三步的条件数）种组合?如果是,那在仪器里如何放置反应管呢?
请教梯度PCR设置梯度问题请问：梯度PCR在变性、退火及延伸三步均可设置梯度,那么如果在摸条件时三步均设置梯度,是否有N*M*K（N、M、K分别代表三步的条件数）种组合?如果是,那在仪器里如
博凌科为-为你梯度PCR只是方便你寻找最佳PCR退火温度,可能减少你做PCR的次数和时间.使用时和楼上的兄弟说的一样,但有一点需要说明一下,就是你所设的温度梯度并不能象楼上的兄弟所说的那么简单,设温度梯度时,第一行的温度是需要一个简单计算的.比如一个12X8的96孔板,如果一共可设12个温度梯度,也就是说每8个孔是一个温度.你所设的初始温度是56度,你设的温度梯度是14,那你每一排的温度相差就是14/12.以些类推.另外,一个PCR引物和体系设计出来以后,如何确定一个基准的温度,然后再根据这个温度上下调整呢?其实一个很实用且简单的方法就是你将你所设计的引物我PCR产物放到Oligo中去评价,它会给你一个最佳的退火温度和循环参数,这个温度实际上就和你通过梯度PCR摸索出来的退火温度几乎是一样的.所以,以我的经验就直接用软件给出的退火温度就没有问题.
在三步法PCR中，变性温度通常设为94℃，也有98℃，温度和时间可以参考PCR酶的说明书；延伸温度通常设为72℃，时间根据酶的扩增效率和目的基因的长度来确定；这两个温度对PCR的影响不是关键的。但退火温度的改变会对PCR产生很大的影响，所以梯度PCR主要是针对退火温度而设计的。在同样的PCR反应体系下，设置的梯度温度为引物Tm值附近的温度范围，比较哪一个退火温度能扩增出目的条带。
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在三步法PCR中，变性温度通常设为94℃，也有98℃，温度和时间可以参考PCR酶的说明书；延伸温度通常设为72℃，时间根据酶的扩增效率和目的基因的长度来确定；这两个温度对PCR的影响不是关键的。但退火温度的改变会对PCR产生很大的影响，所以梯度PCR主要是针对退火温度而设计的。在同样的PCR反应体系下，设置的梯度温度为引物Tm值附近的温度范围，比较哪一个退火温度能扩增出目的条带。
反应管的放置由PCR仪的设置决定，我所使用的梯度PCR 仪是48孔的模块，一横排一个温度，最多可设8个不同退火温度，放反应管的地方里面的温度最高，外面温度最低；如果是96孔的模块，最多可设12个不同退火温度，具体你要看说明书对于仪器的详细说明。
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