转基因植株的分子检测 以烟草和水稻为例 满意的话可以把剩余的积分全部献上
来源：学生作业帮助网 编辑：六六作业网 时间：2024/12/27 05:53:56
转基因植株的分子检测 以烟草和水稻为例 满意的话可以把剩余的积分全部献上
转基因植株的分子检测
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植物细胞经载体法间接或物化法直接转化后,大部分细胞是没有转化的,这就需要将这些未转化细胞与极少数转化细胞区别开来,淘汰未转化细胞,然后利用植物细胞的全能性在适宜的环境条件下,使转化细胞再生成可育的转基因植株.这一过程通常采用筛选标记基因（screenable marker gene）,如抗菌素抗性基因、抗除草剂基因等来进行.当受体细胞本身不含此类基因时,导入含有或构建有此类基因的供体后,只要其在受体中转化成功,便可用抗菌素或除草剂等进行筛选.由于含除草剂的基因工程植物对人畜无毒害等副作用,是人们喜爱选用的筛选标记.
此外,外源基因是否导入成功,还必须对所获得的转基因植株进行检测才能确定.检测的方法很多,但目的不外乎是检测外源基因是否整合到植物基因组中,是否转录和翻译出蛋白产物,以及转译的水平.
1．外源基因整合到植物基因组的检测
Southern杂交、多聚酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）、报告基因（reporter gene）检测等都是检测外源基因整合到植物基因组中的有效方法.Southern杂交是DNA－DNA杂交,它是将凝胶分离的DNA通过毛细管作用将其转移到硝酸纤维膜上,保持其相对位置不变,然后根据碱基互补原理把固定的DNA与标记（如同位素、生物素等）过的探针杂交,从而检测酸中是否存在特定DNA序列.它不仅可以验证外源DNA是否整合,还可初步估计插入的拷贝数.PCR检测则是针对外源基因的序列,设计一对或多对特异引物,对提取的待检测DNA的进行PCR扩增,进而通过凝胶电泳分离检测其特异条带的有无,来证明外源基因是否整合进入受体植株的基因组.报告基因通常是编码一个在离体条件下易于检测的酶,或者最好是可以在活体条件下进行组织化学定位,这样就可以提供定量的和定性的信息,显示外源基因是否导入.常用的报告基因有 Nos、Ocs、Luc（luciferase,萤光素酶）和GUS（β-glucuronidase,β-葡糖醛酸糖苷酶）基因等.
2．外源基因在植物基因组中转录的检测
Northern杂交是DNA-RNA杂交,它是检测特定组织或器官中外源基因是否转录出mRNA 一种有用的方法.其原理与Southern杂交是一致的.
3．外源基因在植物基因组中翻译的检测
Western杂交则是蛋白质间的杂交,它是检测特定组织或器官中外源基因是否有翻译出特定蛋白质的方法.其方法是将聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳分离抗原（antigen）固定并转到固体支持物（如硝酸纤维膜或NC膜等）上,然后放在牛血清蛋白或奶粉溶液中温育,以封闭未结合位点,再用特定抗体杂交,抗原 - 抗体结合,经染色后,即可观察分析外源基因表达产生的蛋白质情况.此外,通过对报告基因的酶活性分析,也可检测其表达状况.