基因工程制药的特点是什么?
来源：学生作业帮助网 编辑：六六作业网 时间：2024/12/24 01:33:41
基因工程制药的特点是什么?
基因工程制药的特点是什么?
基因工程制药的特点是什么?
目的基因的获得
一,逆转录法
逆转录法是先分离纯化目的基因的mRNA,再反转录成cDNA,然后进行cDNA的克隆表达.
1,mRNA的纯化
mRNA的特点:3'末端含有一多聚腺苷酸组成的末端.
方法:亲和层析法
2,cDNA第一链的合成
一般 mRNA都带有3'-polyA,所以可以用寡聚dT作为引物,在逆转录酶的催化下,开始cDNA链的合成.
用放射性探针法检测.
3,cDNA第二链的合成
以cDNA第一链为模板合成第二链.
4,cDNA克隆
用于cDNA克隆的载体有两类:质粒DNA和噬菌体.又将其分为表达型载体和非表达型载体.选用表达型载体可以增加目的基因的筛选方法,有利于目的基因的筛选.
cDNA片段与载体的连接通常采用下面方法:
加同聚尾连接:在载体和cDNA的3'末端加上互补的同型多聚酶序列.
人工接头连接:所谓人工接头是指用人工合成的,连接在目的基因两端的含有某些限制酶切点的寡核苷酸片断.
5,将重组体导入宿主细胞
6,cDNA文库的鉴定
7,目的cDNA克隆的分离和鉴定
(1)核酸探针杂交法
(2)免疫反应鉴定法
逆转录-聚合酶反应法.该方法是mRNA经逆转录合成cDNA第一链,不需再合成第二链,而是在特异引物的协助下,用PCR法进行扩增,特异地合成目的cDNA链,用于重组,克隆.
二,化学合成法
前提:较小的蛋白质或多肽的编码基因,必须知道目的基因的核苷酸排列顺序,或知道目的蛋白质的氨基酸顺序,再按相应的密码子推导出DNA的碱基序列.
操作:见书
限制:一,不能合成太长的基因.
二,人工合成基因时,遗传密码的简并会为选择密码子带来很大的困难.
三,费用高
基因表达
基因表达是指结构基因在生物体中的转录,翻译以及所有加工过程.
基因表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动,即剪切下一个外源基因片断,拼接到另一个基因表达体系中,使其能获得既有原生物活性又可高产的表达产物.
一,宿主细胞的选择
宿主细胞应满足的要求:
分类:第一类为原核细胞,如大肠杆菌等;第二类为真核细胞,如酵母等.
1,原核细胞
(1)大肠杆菌:目前采用最多的原核表达体系.
(2)枯草芽孢杆菌
(3)链霉菌
2,真核细胞
(1)酵母:酿酒酵母应用广泛.
(2)丝状真菌
(3)哺乳动物细胞
二,大肠杆菌中的基因表达
1,载体
表达载体必须具备的条件:
(1)载体能够独立的复制
(2)具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记
(3)具有很强的启动子
(4)具有阻遏子
(5)有很强的终止子
(6)有翻译的起始信号
常用的表达载体:
(1)pBV220系统
(2)pET系统
2,影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素
(1)外源基因的拷贝数
(2)外源基因的表达效率
①启动子的强弱
②核糖体结合位点
③SD序列和起始密码子ATG的间距
④密码子组成
(3)表达产物的稳定性
(4)细胞的代谢负荷
(5)工程菌的培养条件
3,真核基因在大肠杆菌中的表达形式
(1)以融合蛋白的表达形式表达药物基因
由一段短的原核多肽和真核蛋白结合在一起的蛋白质,称为融合蛋白.
(2)以非融合蛋白的形式表达药物基因
(3)分泌型表达蛋白药物基因
三,酵母中的基因表达
1,载体
(1)载体的复制序列 包括YEp类,YRp类,YRp类和YIp类.
(2)克隆载体 由于从大肠杆菌中制备质粒比从酵母中容易,所以酵母质粒的加工和制备大部分是通过大肠杆菌进行的.
(3)表达载体 包括普通表达载体和精确表达载体.
2,影响目的基因在酵母菌中表达的因素
(1)外源基因的拷贝数
(2)外源基因的表达效率 主要与启动子,分泌信号和终止序列有关.
(3)外源蛋白的糖基化
(4)宿主菌株的影响 表达用的酵母宿主菌应具备①菌体生长力强.②菌体内蛋白酶要较弱.③菌株性能稳定.④ 分泌能力强.
四,动物细胞中的基因表达