λ噬菌体载体是什么?

λ噬菌体载体是什么?
λ噬菌体载体是什么?

λ噬菌体载体是什么?
第二节 λ噬菌体载体
λ噬菌体,一种大肠杆菌双链RNA噬菌体.
λ噬菌体的分子量为 31 ×106dal,是一种中等大小的温和噬菌体.迄今已经定位的λ噬菌体的基因至少有61个,其中有一半左右参与了噬菌体生命周期的活动,我们称这类基因为λ噬菌体的必要基因；另一部分基因,当它们被外源基因取代之后,并不影响噬菌体的生命功能,我们称这类基因为λ噬菌体的非必要的基因.
一．λ噬菌体的分子生物学概述
（1）λ噬菌体基因组的结构
在λ噬菌体线性双链 DNA分子的两端,各有一条由12个核劳酸组成的彼此完全互补的5′单链突出序列,即通常所说的粘性末端.注入到感染寄主细胞内的λ噬菌体的线性DNA分子,会迅速地通过粘性末端之间的互补作用,形成环形双链DNA分子.随后在DNA连接酶的作用下,将相邻的5′-P和3′-OH基团封闭起来,并进一步超盘旋化.这种由粘性末端结合形成的双链区段称为cos位点（略语cos,系英语cohesive-end site的缩写,即粘性末端位点之意）（图5-5）.
在环化的状态下,λ噬菌体DNA分子的长度为48 502碱基对.
（2）λ噬菌体DNA的复制
在λ噬菌体感染的早期,环形的λ DNA分子按θ形式从双向进行复制.到了感染的晚期,控制滚环复制机理的开关被启动了,合成出了由一系列线性排列的人基因组oxA组成的长多连体分子.
（3）λ噬菌体DNA的整合与删除
λ噬菌体基因组的整合作用,是通过它的附着位点att,同大肠杆菌染色体DNA的局部同源位点之间的重组反应实现的.整合作用需要int基因的表达,它是一种可逆的过程.的复制子,这种过程叫做原噬菌体的删除作用.λ噬菌体的删除,需要噬菌体xis基因和bio基因的协同作用才能实现.
（4）λ噬菌体DNA的转录与转译
在溶菌周期,λ噬菌体DN A的转录是在三个时期,即早期、中期和晚期发生的.大体的情况是,早期基因转录确立起溶菌周期；中期基因转录的结果导致 DNA进行复制和重组；晚期基因的转录最终使DNA被包装为成熟的噬菌体颗粒.
二．λ噬菌体载体的构建及其主要类型
（1）构建λ噬菌体载体的基本原理
构建λ噬菌体载体的基本原理是多余限制位点的删除.
按照这一基本原理构建的λ噬菌体的派生载体,可以归纳成两种不同的类型：
一种是插入型载体（insertion vectors）,只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点.
另一种是替换型载体（rePlacement vectors）,具有成对的克隆位点,在这两个位点之间的人 DNA区段可以被外源插入的 DNA片段所取代(如图5-6).
在基因克隆中的二者的用途不尽相同.插入型载体只能承受较小分子量（一般在10kb以内）的外源DNA片段的插入,广泛应用于cDNA及小片段DNA的克隆.而替换型载体则可承受较大分子量的外源DNA片段的插入,所以适用于克隆高等真核生物的染色体DNA(如图5-7).
（2）λ噬菌体载体的主要类型
（i）插入型载体
外源的DNA克隆到插入型的λ载体分子上,会使噬菌体的某种生物功能丧失效力,即所谓的插入失活效应.插入型的λ载体又可以分为免疫功能失活的（inactivatiort of immunityfunction）和大肠杆菌β-半乳糖苷酶失活的（inactlvatlon of E．coli β-galactosidase）两种亚型.
①免疫功能失活的插入型载体：在这类插入型载体的基因组中有一段免疫区,其中带有一两种核酸内切限制酶的单切割位点.当外源DNA片段插入到这种位点上时,就会使载体所具有的合成活性阻遏物的功能遭受破坏,而不能进入溶源周期.因此,凡带有外源DNA插入的λ重组体都只能形成清晰的噬菌斑,而没有外源DNA插入的亲本噬菌体就会形成混浊的噬菌斑.
②β-半乳糖苷酶失活的插入型载体：它们的基因组中含有一个大肠杆菌的lac5区段,其中编码着β半乳糖着酶基因lacZ.由这种载体感染的大肠杆菌lac-指示菌,涂布在补加有IPTG和Xgal的培养基平板上,会形成蓝色的噬菌斑.如果外源DNA插入到lac5区段上,阻断了β-半乳糖着酶基因lacZ的编码序列,不能合成β-半乳糖昔酶,只能形成无色的噬菌斑.
（ii）替换型载体
替换型载体又叫做取代型载体（substitution vector）,是一类在λ噬菌体基础上改建的、在其中央部分有一个可以被外源插入的DNA分子所取代的DNA片段的克隆载体.
λNM781便是其中的一个代表.在这个替换型载体中,可取代的EcoRI片段,编码有一个supE基因（大肠杆菌突变体tRNA基因）,由于这种λNM781噬菌体的感染,寄主细胞lacZ基因的琥珀突变更被抑制了,能在乳糖麦康基氏（MacConkey）琼脂培养基上产生出红色的噬菌斑,或是在Xgal琼脂培养基上产生出蓝色的噬菌斑.如果这个具有supE基因的EcoRI片段被外源DNA取代了,那么所形成的重组体噬菌体,在上述这两种指示培养基上都只能产生出无色的噬菌斑.
用替换型载体克隆外源DNA包括三个步骤：
第一,应用适当的核酸内切限制酶消化λ载体,除去基因组中可取代的DNA区段.
第二,将上述所得的人 DNA臂同外源DNA片段连接.
第三,对重组体的λDN A分子进行包装和增殖,以得到有感染性的λ重组噬菌体.
三．λ重组体DNA分子的体外包装
（1）λ重组体DNA分子的转染作用
用λ重组体DNA分子直接感染大肠杆菌,使之侵入寄主细胞内.这种由寄主细胞捕获裸露的噬菌体DNA的过程叫做转染（transfection）,它有别于以噬菌体颗粒为媒介的转导（kransduction）.
λDNA的转染作用,是一种低效的过程.即便是使用未经任何基因操作处理的新鲜制备的λ DNA,其典型的转染效率（即每微克λDNA转染产生的噬菌斑数目）,也仅为 105～106之间.体外连接的结果,转染效率便下降到了104～103左右.
（2）λDNA的体外包装
λDNA的体外包装作用,在离体条件下,将重组体DNA包入噬菌体等病毒颗粒中的过程,以形成有功能的病毒载体.
根据体外互补作用研究发现,λ噬菌体的头部和尾部的装配是分开进行的.头部基因发生了突变的噬菌体只能形成尾部,而尾部基因发生了突变的噬菌体则只能形成头部.将这两种不同突变型的噬菌体的提取物混合起来,便能够在体外装配成有生物活性的噬菌体颗粒.这就是噬菌体体外包装所依据的基本原理.（图5-8）
（3）λ噬菌体DNA的包装限制问题
λ噬菌体头部外壳蛋白质容纳DNA的能力是有一定限度的.上限不得超过其正常野生型DNA总量的5％左右,而低限又不得少于正常野生型DNA总量的75％.
按野生型λDNA分子长度为 48kb计算,λ噬菌体的包装上限是 51kb.编码必要基因的DNA区段占28kb,因此λ载体克隆外源DNA的理论极限值应是23kb.