动物组织提取基因组DNA的步骤和试剂
来源：学生作业帮助网 编辑：六六作业网 时间：2024/12/22 23:53:18
动物组织提取基因组DNA的步骤和试剂
动物组织提取基因组DNA的步骤和试剂
动物组织提取基因组DNA的步骤和试剂
一、实验原理
真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）都能用来制备基因组 DNA.真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内,因此,制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离,又要保持DNA分子的完整.提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质,再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质,得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出.
蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在下保持很高的活性.在匀浆后提取DNA的反应体系中,SDS可破坏细胞膜、核膜,并使组织蛋白与DNA分离,EDTA则抑制细胞中Dnase的活性；而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸,使DNA分子完整地分离出来.
二、仪器及试剂
1.仪器：
恒温水浴锅、台式离心机、紫外分光光度计（GeneQuant）、移液器、玻璃匀浆器、离心管（灭菌）、吸头（灭菌）
2.试剂：
（1）细胞裂解缓冲液：
Tris (pH8.0) 100 mmol/L
EDTA (pH 8.0) 500 mmol/L
NaCL 20 mmol/L
SDS 10%
胰RNA酶 20ug/ml
（2）蛋白酶K：称取20mg蛋白酶k溶于1ml灭菌的双蒸水中,C20℃备用.
（3）TE缓冲液（pH 8.0）：高压灭菌,室温贮存.
（4）酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）、
（5）异丙醇、冷无水乙醇、70%乙醇、灭菌水.
三、操作步骤
1.取新鲜或冰冻动物组织块0.1g（0.5cm3）,尽量剪碎.置于玻璃匀浆器中,加入1ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块,转入1.5ml 离心管中,加入蛋白酶K （500ug/ml）20μl,混匀.在65℃恒温水浴锅中水浴30min,也可转入37℃水浴12～24h,间歇振荡离心管数次.于台式离心机以12000 rpm离心5min,取上清液入另一离心管中.
2.加2倍体积异丙醇,倒转混匀后,可以看见丝状物,用100ul 吸头挑出,凉干,用200ul TE 重新溶解.（可进行PCR反应等,需要进一步纯化的按下列步骤进行）
3.加等量的酚：氯仿：异戊醇振荡混匀,离心12000 rpm,5min.
4.取上层溶液至另一管,加入等体积的氯仿?异戊醇,振荡混匀,离心12000 rpm,5min.
5.取上层溶液至另一管,加入1/2体积的7.5mol/L乙酸氨加入2倍体积的无水乙醇,混匀后室温沉淀2min ,离心12000 rpm ,10min.
6.小心倒掉上清液,将离心管倒置于吸水纸上,将附于管壁的残余液滴除掉.
7.用1ml 70%乙醇洗涤沉淀物1次,离心12000 rpm ,5min.
8.小心倒掉上清液,将离心管倒置于吸水纸上,将附于管壁的残余液滴除掉,室温干燥.
9.加200ul TE重新溶解沉淀物,然后置于4℃或?C20℃保存备用.
10.吸取适量样品于GeneQuant上检测浓度和纯度.
四、常见问题
1.选择的实验材料要新鲜,处理时间不易过长.
2.在加入细胞裂解缓冲液前,细胞必须均匀分散,以减少DNA团块形成.
3.提取的DNA不易溶不纯,含杂质较多；加溶解液太少使浓度过大.沉淀物太干燥,也将使溶解变得很困难.
4.电泳检测时DNA成涂布状：操作不慎；污染核酸酶等.
5.分光光度分析DNA的A280/A260小于1.8；不纯,含有蛋白质等杂质.在这种情况下,应加入SDS至终浓度为0.5%,并重复步骤2～8.
6.酚/氯仿/异戊醇抽提后,其上清液太黏不易吸取：含高浓度的DNA,可加大抽提前缓冲液的量或减少所取组织的量.