怎样检测细胞的生长,存活及增殖
来源：学生作业帮助网 编辑：六六作业网 时间：2024/11/06 09:25:05
怎样检测细胞的生长,存活及增殖
怎样检测细胞的生长,存活及增殖
怎样检测细胞的生长,存活及增殖
BrdU标记法
1．细胞以1.5×105/ml细胞数接种于直径35ml培养皿中（内放置一盖玻片）,培养1天,用含0.4％ FCS培养液同步化3天,使绝大多数细胞处于G0期.
2．终止细胞培养前,加入BrdU（终浓度为30μg/L）,37℃,孵育40min.
3．弃培养液,玻片用PBS洗涤3次.
4．甲醇/醋酸固定10min.
5．经固定的玻片空气干燥,0.3％H2O2-甲醇30min灭活内源性氧化酶.
6．5％正常兔血清封闭.
7．甲酰胺100℃,5min变性核酸.
8．冰浴冷却后PBS洗涤,加1抗即抗小鼠BrdU单抗（工作浓度1：50）,阴性对照加PBS或血清.
9．按ABC法进行检测,苏木素或伊红衬染,在显微镜下随机计数10个高倍视野中细胞总数及BrdU阳性细胞数,计算标记指数（LI）.
结晶紫法
1．体外细胞培养结束后,去培养液,加入11％的戊二醛固定,置于振荡器上摇20min.
2．固定细胞用去离子水洗涤至戊二醛液洗净.
3．置空气或烘箱37℃彻底干燥.
4．加入0.1％的结晶紫液对细胞染色,振摇30min.
5．用蒸馏水洗涤,至多余的结晶紫液冲洗干净.
6．置空气或37℃烘箱中彻底干燥.
7．加入10％的乙酸对细胞吸收的结晶紫进行提取.
8．1h后在酶标仪上测定光吸收度,波长595nm.
酸性磷酸酶法
1．96孔细胞培养板中培养细胞,去培养液.用0.01mol/L PBS洗涤1次（如为悬浮细胞则用离心洗涤）.
2．去洗涤液后加入磷酸酶底物100μl/孔.
3．37℃,孵育1～4h.
4．加入0.1mol/L氢氧化钠10μl/孔.
5．在多孔酶标仪上405nm处测光吸收度,将细胞培养板其中不含细胞,同样处理过的一孔作为空白对照,所测的每孔光吸收度可间接反应每孔中的细胞数.如在同样条件下作一细胞数的系列标准对照,以细胞数为X轴,光吸收度为Y轴,可作直线回归,可推算出每孔中的细胞.