怎样培养流感病毒

怎样培养流感病毒
怎样培养流感病毒

怎样培养流感病毒
1 用于培养流感病毒的细胞1󰀁1 细胞株的选择 在最初培养流感病毒的时候用鸡胚,但鸡胚分离流感病毒容易引起病毒便变异和过敏性反应,还存在大规模生产时外源病毒的污染问题.而运用Vero和MDCK细胞培养流感病毒不但解决了上述问题,还使得病毒的免疫原更稳定.戚凤春[1]等人研究发现,相同的实验条件下,在MDCK细胞上培养的病毒HA滴度明显高于Vero细胞,因此我们培养流感病毒细胞株的选择MDCK细胞,其代数最好小于35代,细胞过老会使病毒不容易负载. 1󰀁2 细胞最佳负载病毒的胞龄 MDCK细胞繁殖非常旺盛,必需只能提前一天将细胞培养瓶里的细胞接种在六孔板中,如果负载病毒用胞龄为两天的MDCK细胞,那么病毒培养的阳性率几乎为0,而胞龄为12-24h的MDCK细胞对病毒的负载阳性率区别不大[2].1󰀁3 细胞负载病毒的最佳密度 首先,MDCK细胞的密度不能太稀,这种细胞密度太稀则不能生长,也不能让细胞密得堆积起来,那样也会很大程度降 低病毒接种的阳性率.最好使细胞刚刚铺满孔,这时负载病毒后收获病毒的HA滴度最高.当工作人员提前一天将细胞接种在6孔板中时,应考虑细胞的生长速度,使其第二天负载病毒时的细胞密度适当.其次,MDCK细胞接种六孔板时要密度均匀,容易出现的情况是细胞都聚集在孔的边缘,而中间密度过稀,这样也会影响病毒负载的阳性率.避免这种情况出现就要工作人员手法熟练,如果出现了这种情况,将培养板轻轻晃动(避免液体溅出),能有效改善细胞的分布.2 培养流感病毒的试剂 用于培养流感病毒试剂的不同也会很大程度影响病毒培养 阳性率.首先,不使用过期的试剂;其次,最好使用知名厂家的试剂,比如GIBCO等;再次,使用前将试剂从冰箱拿出一段时间,最好等试剂的温度已经平衡到室温再用.如果是给细胞换代,过冷的试剂会影响细胞的生长状态;如果是负载病毒前洗细胞用,过冷的试剂会使细胞突然皱缩而病毒培养的阳性率.3 样品 3󰀁1 样品的存放 样品存放的时间直接影响病毒负载的阳性率,标本越新鲜,病毒培养的阳性率越高.如果样品不能及时负载细胞,应将样品放在-70!冰箱中,避免反复冻融,冻融次数越多,病毒培养的阳性率越低.注意不能将样品放在-20!的冰箱中,流感病毒在-20!非常不稳定,如果当天的样本要第二天才能接种,应将样品放在4!冰箱中.3󰀁2 样品的无菌处理 因为样品的采样条件不可能无菌,虽然采样液中有抗生素,也不能保证细菌全被杀死,所以阳性样本最好过滤到无菌的1󰀁5ml离心管中备用.有些工作人员采用往细胞培养板中加抗生素避免污染,这样虽然省事,但会对细胞有伤害,从而降低了病毒培养的阳性率.4 病毒负载的操作步骤4󰀁1 细胞洗涤 将六孔板中的细胞培养液倒去,用HBSS洗涤每一孔三遍以上,其作用是洗去残留的FBS,FBS通过抑制胰酶而抑制流感病毒的复制.将洗液倒去后,应立即加入洗液或病毒液,过长时间将细胞暴露在空气中将很大程度降低病毒培养的阳性率,最好将细胞暴露在空气中的时间缩短在5秒以内.4󰀁2 病毒液的接种量 病毒液的接种很有讲究.负载在细胞上的病毒液应大于300u,l否则不够盖过整孔细胞.待37!孵育1~2h后,不管开始负载了多少体积的病毒液,都应在每孔留300ul病毒液再加入病毒培养基,若病毒液全都弃去或留得太少,会使病毒培养阳性率大打折扣;若病毒液留得太多,比如超过400u,l也会使阳性率降低很多,因为存留过多的缺损病毒会严重影响正常病毒的复制.4󰀁3 病毒液的孵育时间 理论上,病毒液在37!孵育1~2h都可以,但我们发现1h还是太短,最好在1h15min加入病毒培养基,不要时间过长,那样也会使病毒培养的阳性率降低,可能是因为采样液的pH值和病毒培养基不同,孵育时间稍长导致细胞受到损伤.而盲传的时候,孵育的时间可以到2h以上,因为这时候所用的病毒液也是病毒培养基,而不是采样液.4󰀁4 病毒培养基的配制 病毒培养基是用DMEM加入HEPES和胰酶配制而成的,HEPES的作用是加强体系的缓冲能力,胰酶的作用是将病毒粒非裂解型的HA0变成裂解型的HA1+HA2,从而提高流感病毒在细胞中的复制能力,因为流感病毒只有血凝素(H)是裂解型的才具有感染性.但是HEPES和胰酶在DMEM在4!共存时间过长会引起pH值上升,所以病毒培养基我们一般都是现配现用. 4󰀁5 病毒HA滴度的测定 CPE出现时间随病毒的型别和毒株的差异以及感染量的大 小而异.我们将标本接种后3d观察是否出现CPE,出现CPE的测定HA滴度,滴度大于8则收获病毒,用HI实验测定病毒亚型,病毒滴度小于8进行盲传,再在第3d测定HA滴度.若负载病毒7d还不出现CPE,维持液中又查不出HA活性,可认为阴性标本,弃之.3d时间出现病毒滴度的 最高峰, 4d和2d都低于3d时病毒的滴度.收获毒株前,将 细胞于-80!/37!冻融一次,有利于增加病毒的HA滴度.

用活鸡胚