十万火急!十万火急!谁能告诉我GST-PULLDOWN的原理以及酵母杂交技术的原理哈?
来源：学生作业帮助网 编辑：六六作业网 时间：2024/12/24 02:13:21
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GST亲和层析和GST Pull-down方法
此方法的基本原理是：利用重组技术将探针蛋
白与GST（Glutathione S transferase）融合,融合蛋
白通过GST与固相化在载体上的GTH（Glutathione）
亲和结合.因此,当与融合蛋白有相互作用的蛋白
通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸
附而分离.在病毒受体研究中,融合蛋白通常设计
为病毒吸附蛋白（VAP）.这方面成功的例子有
HBV[28].具体做法如下：将GST-融合探针蛋白
（VAP）和GTH-Sepharose制成亲和层析柱,然后待
分析的蛋白质混合液流经亲和层析柱,梯度洗脱,
分离、收集各蛋白组分,这称为GST亲和柱层析
（GST affinity column chromatography）.如果一开
始待检蛋白就和GST- 融合探针蛋白与
GTH-Sepharose一起共同孵育,经离心收集洗脱复
合物和洗涤后,再加入过量GTH获得相互作用蛋白
的复合物,那么这种方法则称为GST pull down.
GST亲和层析及相应的GST Pull-down方法的
优点是敏感,对混合物中的所有蛋白均“一视同仁”,
也可用于受体功能的鉴定.缺点是GST有可能影响
融合蛋白的空间结构,另外,蛋白质浓度对实验也
有一定影响.
3.6 酵母双杂交技术
许多真核生物的转录激活因子通常具有两个
可独立存在的结构域,即DNA结合域（BD）与转
录激活域（AD）.这两个结构域各具功能,互不影
响.但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必
须同时含有这两个结构域.不同来源的激活因子的
BD区与AD结合后则可特异地激活被BD结合的基
因表达.基于这个原理,人们将两个待测蛋白分别
与这两个结构域建成融合蛋白,并共表达于同一个
酵母细胞内.如果两个待测蛋白间能发生相互作用
就会使AD与BD形成完整的转录激活因子并激活相
应的报告基因表达.通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用.
酵母双杂交系统由三个部分组成：①与BD融合
的蛋白表达载体,被表达的蛋白称诱饵蛋白（bait）；
②AD融合的蛋白表达载体,其表达的蛋白称靶蛋
白（prey）；③带有一个或多个报告基因的宿主菌株.
常用的报告基因有HIS3、URA3、LacZ和ADE2等.
而菌株则具有相应的营养缺陷型.
双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营
养标记基因,有利于杂交质粒的鉴定与分离.根据
目前通用系统中BD来源主要分为GAL4系统和
LexA系统.后者因BD来源于原核生物,在真核生
物内缺少同源性,因此可以减少假阳性的出现.
近年来,开始出现了应用酵母双杂交技术进行
病毒受体研究的成功报告,如麻疹病毒的绒猴细胞
受体[30].李凌云等构建了表达“猎物”（prey）蛋白
的质粒和表达病毒VAP“诱饵”（bait）蛋白的质粒,
然后共转染同一酵母细胞,利用已建立的易感细胞
cDNA文库,筛到了阳性克隆.
酵母双杂交技术的优点是灵敏度高,特异性较
好,缺点是容易出现假阳性和假阴性,而且对蛋白
质在细胞中的定位有要求.
为了克服上述缺点,人们进一步优化出所谓“双
筛选系统”,即蛋白质相互作用必须同时激活两个
以上报道基因,具有两种以上的相应表型才算是真
的阳性结果.另外,人们也改造了酵母双杂交系统
所用的载体系统,将在细胞浆内发生的蛋白质相互
作用转移到细胞膜上进行,以此来更容易地筛选膜
蛋白受体,如Ras recruitment system（RRS）.