G418原代细胞如何筛选?
来源：学生作业帮助网 编辑：六六作业网 时间：2024/12/23 02:14:39
G418原代细胞如何筛选?
G418原代细胞如何筛选?
G418原代细胞如何筛选?
博凌科为分析转化的功能和表达需要DNA稳定转染至宿主细胞染色体.外源基因进入细胞后,部分能够通过细胞质进入细胞核内,根据细胞类型,至多80%的进入 核内的外源DNA得到瞬时表达.极少数情况下,进入细胞的外源DNA通过系列非同源性分子间重组核连接,形成巨大的***结构最终整合进细胞染色体.细胞 基因组自由部分表达,所以整合并不一定意味着表达,只有整合到表达区的基因才会表达,而且整合到不同的染色体区段的外源基因的表达的量也是不同的.由于摄 取、整合、表达外源基因是小概率事件,通常根据新表型筛选稳定转染体.一般情况下这种新表型由共转染的编码抗生素抗性基因提供.细菌Tn5转座子序列 （neo抗性基因）携带的氨基糖苷磷酸转移酶可以将G418转变成无毒形式.G418是一种氨基糖类抗生素,其结构与新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似,它 通过影响80S核糖体功能而阻断蛋白质合成,对原核和真核等细胞都有毒性,包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞,也包括原生动物和蠕虫.是稳定转染最常用 的选择试剂.当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后,则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA,从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效 表达,使细胞获得抗性而能在含有G418的选择性培养基中生长.G418的这一选择特性,已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛 应用.在进行转染时细胞膜受到影响,抗生素可能对细胞产生较大影响,加上G418有杀菌作用,所以有人主张转让时不加其它抗生素.其实G418本身有很好 的杀菌效果,在用G418进行筛选的过程中很少会发生污染.但有一点,其实我觉得问题也不是很大,那就是：在老外的一本实验手册中提到,在脂质体转染时所 用培养基中最好不加任何抗生素.我想他的想法可能是脂质体对细胞膜有影响,可能此时加抗生素对细胞损伤较大.因为庆大霉素、链霉素、G418均是氨基糖甙 类药物,其药理作用完全一样.所以没有必要再用,而且由于另外抗生素的添加实际增加氨基糖甙类药物的浓度,剂量有误差,不利于各实验室之间的交流,在实际 操作中,培养液中有抗生素对细胞培养与筛选影响不大.Protocal1.G418的配制： 取1g G418溶于1ml 1M的HEPES液中,加蒸馏水至10ml,过滤消毒,4度保存.2.细胞培养：取待测培养细胞,制备成细胞悬液,按等量接种入多孔培养板中,培养6小时左右开始加药.3.制备筛选培养基：在100g/ml～1000g/ml范围内确定几个梯度,比如先做个100g/ml、400g/ml、800g /ml、1000g/ml,按梯度浓度用培养基稀释G418制成筛选培养基.4.加G418筛选： 吸除培养孔中培养基,PBS洗涤一次,每孔中加入不同浓度的筛选培养基.5.换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况,每3~5天更换一次筛选培养基.方法同4.6.确定最佳筛选浓度：在筛选10～14天内能够杀死所有细胞的最小G418浓度即为最佳筛选浓度.在第一轮就筛选出最佳G418浓度的可能性不 大,最有可能的是出现这种情况：用某一浓度G418的量在筛选14天后还不能杀死细胞,而用下一个梯度的G418的量在10天前就看不到活细胞了.假如是 400g/ml不能杀死细胞,而800g/ml在第5天就把所有细胞都杀死了,则可以再用500g/ml、600g/ml、700g/ml进一 步筛选,以确定最佳筛选浓度!心得：由于特性明确的细胞系G418的最佳用量还是比较稳定的,所以有时候不需要在这么大范围内进行筛选.比如说你要转染 NIH3T3细胞,现在我告诉你我测试过NIH3T3细胞对G418的敏感性,我用的筛选浓度是200g/ml.这时你就可以做150g/ml、 200g/ml、300g/ml三个浓度进行筛选