为什么酶切实验要求加样迅速,要在冰上进行操作?
来源：学生作业帮助网 编辑：六六作业网 时间：2024/11/15 19:52:47
为什么酶切实验要求加样迅速,要在冰上进行操作?
为什么酶切实验要求加样迅速,要在冰上进行操作?
为什么酶切实验要求加样迅速,要在冰上进行操作?
连接前最好将水、插入片段和载体混合好以后置于45度水浴5min,马上置于冰上冷却,再加入buffer和ligase.
双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜,其实完全没有必要,我一般酶切3个小时,其实1个小时已经足够.应用大体系,如100微升.
纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式,我推荐柱式,因为割胶手法不准,很容易割下大块的胶,影响纯化效率.现在的柱式纯化号称可以祛除引物,既然如此,酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了.所以,PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化.我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒
酶量的问题：以TAKARA的为例,其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中,30℃温度下反应1小时,将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U).而该酶浓度约为15单位/微升,在除外酶降解的 因素外,该酶可分解15μg的DNA,而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约为3μg,而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg,所以即便全部加进去,只要纯化的 质量好,酶切完全切得动.
我觉得跟酶的活性有关．你希望反应只在你设定的条件下和时间范围内进行．但是一旦底物和酶混合，就有可能开始发应，这样子有两个可能问题，一是加样时，如果放在室温，而又不是酶的最佳反应温度，有可能出现非特异性反应，二是加样如果太慢，先加的样比后加的样总反应时间长太多，结果就产生误差．冰降低温度，有可能是暂时抑制酶活性的作用．...
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我觉得跟酶的活性有关．你希望反应只在你设定的条件下和时间范围内进行．但是一旦底物和酶混合，就有可能开始发应，这样子有两个可能问题，一是加样时，如果放在室温，而又不是酶的最佳反应温度，有可能出现非特异性反应，二是加样如果太慢，先加的样比后加的样总反应时间长太多，结果就产生误差．冰降低温度，有可能是暂时抑制酶活性的作用．
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