刚才无意中看到你给别人的回复,受益匪浅!但我是纯新手还是有点不懂,我需要构建一个表达载体,然后首先得pcr这个基因吧?那我手边又没有这个基因的什么细胞啊、组织啊什么,如何获得模版
来源：学生作业帮助网 编辑：六六作业网 时间：2024/12/18 13:40:22
刚才无意中看到你给别人的回复,受益匪浅!但我是纯新手还是有点不懂,我需要构建一个表达载体,然后首先得pcr这个基因吧?那我手边又没有这个基因的什么细胞啊、组织啊什么,如何获得模版
刚才无意中看到你给别人的回复,受益匪浅!但我是纯新手还是有点不懂,
我需要构建一个表达载体,然后首先得pcr这个基因吧?那我手边又没有这个基因的什么细胞啊、组织啊什么,如何获得模版呢?.
其实,我连引物都不会设计.但模版这不懂,卡的我心痒!麻烦!你额!
刚才无意中看到你给别人的回复,受益匪浅!但我是纯新手还是有点不懂,我需要构建一个表达载体,然后首先得pcr这个基因吧?那我手边又没有这个基因的什么细胞啊、组织啊什么,如何获得模版
我只是说一点简单的流程啊.具体的问题可能会更多,也不可预料的.从引物设计到构建好载体我一块说了吧.
想得到模板,第一你是要有原始的细胞组织之类的,反正能够表达你的蛋白的就行.如果没有,第二种方法,找别人要,看看有没有人有这个序列,或者细胞组织都行.如果还是不行,第三种方法是找生物公司合成这个序列,现在还比较贵可能.其他的办法,几乎没有了.哦还有一个办法就是购买别人做好的cDNA文库.
首先最开始的是引物,啊不,是分析目标序列.
你要先得到这个基因的完整序列啊,不管是什么生物体的,反正要是完整的open reading frame区.也就是编码你的蛋白的序列.然后看一下有多长,太长的话 PCR效率会太低,是不行的.我最长到过一次PCR 1700bp,再长不能保证了（不是PCR不出来,而是产物太少,不足以跑胶分析）.然后就是分析一下酶切位点,看看你可以使用和你质粒匹配的哪些酶切位点不在序列里面.不在就能使用,从中选择一对儿使用.看看有没有GC rich区,如果有,PCR要加DMSO的.
设计一对终端引物
对于新手来说.最简单的方法就是从5‘端开始一段20多bp的片段,再5’端加上酶切位点,就是正向引物.从3‘端也拉一段,在3’端加上酶切位点,再反向互补过来,就是反向引物.如果超过1500bp,我的建议是每1000bp加一对overlap引物（你用得着再说吧）.然后合成好就行了.
准备模板
你需要的模板是要自己准备的.如果已经有别人的质粒（或者自己的）带有你的序列,直接拿质粒做模板就好.如果没有质粒的话,我们做的是人的基因,就是首先确定一个表达这个蛋白的细胞系,然后培养这个细胞系,收集起来提取总RNA,反转录成cDNA,这个就是模板了,从cDNA里面PCR.
你的cDNA模板不一定质量高的,或者细胞系也不一定合适的.看情况吧.
PCR
有了cDNA模板和引物,你就可以PCR了,这个过程可能不会太顺利,要慢慢调整才行.可以调整的因素很多很多：延伸温度、退火温度、变性温度以及三个温度的时间、引物浓度、模板浓度、Taq酶浓度甚至种类、镁离子、DMSO、GCrich-buffer、热启动PCR、nest-PCR等等等等,太多了.反正慢慢来吧.目标是最终看到合适的条带（可能有杂带,不过你只要能分离出来就好）
这样PCR得到基因的部分就成功了.
PCR之后肯定是跑胶回收,然后酶切（同时酶切你的质粒）,然后就是连接,转化,挑取菌落单克隆,鉴定,测序.测序结果回来了,正确,大功告成!后面的部分是分子生物学中protocol式的实验,你如果有问题再问我吧.
大概就是这个样子,可能实际过程中会有更多不同的情况.我曾经遇到过非常顺利的情况,也遇到过非常非常不顺的情况.慢慢来总会有办法就是啦.
Good Luck to you