如何由细胞色素C粗提品制备精品?

如何由细胞色素C粗提品制备精品?
如何由细胞色素C粗提品制备精品?

如何由细胞色素C粗提品制备精品?
用高效液相色谱法或者凝胶过滤色谱做呗.这个是目前最常用的办法啊.过柱子就能行了,色谱纯已经很纯了

细胞色素C是一种细胞色素氧化酶，，是电子传递链中唯一的外周蛋白，位于线粒体内侧外膜。可以参照酶的提纯吧？
【实验操作】
1．细胞色素C的制备
⑴ 材料处理:
取新鲜或冰冻猪心，除去脂肪和韧带，用水洗去积血，将猪心切成小块，放入绞肉机绞碎。
⑵ 提取:
称取绞碎猪心肌肉500克，放人2000m1烧杯中，加蒸馏水1000ml，在电动搅拌器搅拌下...

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细胞色素C是一种细胞色素氧化酶，，是电子传递链中唯一的外周蛋白，位于线粒体内侧外膜。可以参照酶的提纯吧？
【实验操作】
1．细胞色素C的制备
⑴ 材料处理:
取新鲜或冰冻猪心，除去脂肪和韧带，用水洗去积血，将猪心切成小块，放入绞肉机绞碎。
⑵ 提取:
称取绞碎猪心肌肉500克，放人2000m1烧杯中，加蒸馏水1000ml，在电动搅拌器搅拌下以2M H2S04调pH至4.0(此时溶液呈暗紫色)，在室温下搅拌提取2小时，在提取过程，使抽提液的pH值保持在4.0左右。在即将提取完毕，停止搅拌之前，以1M NH40H调pH至6.0，停止搅拌。用八层普通纱布压挤过滤，收集滤液。滤渣加入750m1蒸馏水，再按上述条件提取1小时，两次提取液合并。
⑶ 中和:
用1M NH4OH调上述提取液至pH 7.2(此时，等电点接近7.2的一些杂蛋白溶解度小，从溶液中沉淀下来)，静置30～40分钟中后过滤，所得滤液准备通过人造沸石柱进行吸附。
⑷ 吸附与洗脱:
人造沸石容易吸附细胞色素C，吸附后能被25％的硫酸铵洗脱下来，利用此特性将细胞色素C与其它杂蛋白分开。具体操作如下：
①人造沸石的预处理：称取人造沸石11g，放入500m1烧杯中，加水搅拌，用倾泻法除去12秒钟内不下沉的过细颗粒。
② 装柱：选择一个底部带有滤膜的干净的玻璃柱(2.5×30cm)，柱下端连接一乳胶管，用夹子夹住，柱中加入蒸馏水至2/3体积，保持柱垂直，然后将己处理好的人造沸石带水装填人柱，注意一次装完，避免柱内出现气泡。
③ 上样：柱装好后，打开夹子放水(柱内沸石面上应保留一薄层水)将准备好的提取液装入下口瓶，使其通过人造沸石柱进行吸附。柱下端流出液的速度为1.0ml/分钟。随着细胞色素C的被吸附，柱内人造沸石逐渐由白色变为红色，流出液应为黄色或微红色。
④ 洗脱：吸附完毕，将红色人造沸石从柱内取出，放入500m1烧杯中，先用自来水，后用蒸馏水搅拌洗涤至水清，再用100m1 0.2％NaCl溶液分三次洗涤沸石，再用蒸馏水洗至水清，按第一次装柱方法将人造沸石重新装入柱内，用25％硫酸铵溶液洗脱，流速大约2ml/分钟，收集含有细胞色素C的红色洗脱液，当洗脱液红色开始消失时，即洗脱完毕。人造沸石可再生使用。
⑤ 人造沸石再生：将使用过的沸石，先用自来水洗去硫酸铵，再用0.25M氢氧化钠和lM氯化钠混合液洗涤至沸石成白色，前后用蒸馏水反复洗至pH7～8，即可重新使用。
⑸盐析：
为了进一步提纯细胞色素C，在上面收集的洗脱液中，加入固体硫酸铵(按每l00m1洗脱液加入20克固体硫酸铵的比例，使溶液硫酸铵的饱和度为45％)边加边搅拌，放置30分针后，杂蛋白便从溶液中沉淀析出，而细胞色素C仍留在溶液中，用滤纸(或离心)除去杂蛋白，即得红色透亮细胞色素C溶液。
(6) 三氯醋酸沉淀：
在搅拌情况向所得透亮溶液加入20％三氯醋酸(2.5m1三氯醋酸/100m1细胞色素C溶液)，细胞色素C立即沉淀出来（沉淀出来的细胞色素C属可逆变性)，立即于3000转/分钟离心15分钟，收集沉淀。加入少许蒸馏水，用玻棒搅拌，使沉淀溶解。
⑺ 透析：
将沉淀的细胞色素C溶解于少量的蒸馏水后，装入透析袋，在500m1烧杯中对蒸馏水进行透析除盐(电磁搅拌器搅拌)，15分钟换水—次，换水3至4次后；检查透析外液SO4是否已被除净。检查方法是：取2m1 BaCl2溶液于试管中，滴加2至3滴透析外液至试管中，若出现白色沉淀，表示SO4未除净，反之，说明透析完全，将透析液过滤，即得细胞色素C制品。
2.含量测定
所得制品是还原型细胞色素C水溶液，在波长520nm处有最大吸收值，根据这一特性，用721型分光光度计，先作出一条标准细胞色素C浓度和对应的光密度值的标准曲线(图1)，然后根据测得的待测样品溶液的光密度值就可以由标准曲线的斜率求出待测样品的含量。具体操作如下：
⑴ 标准曲线的绘制：
取1毫升标准品(81mg/ml)，稀释至25ml，从中分别取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml，分别置于五支试管中，每管补加蒸馏水至4m1，并加少许联二亚硫酸钠作还原剂，然后在520nm处测得各管的光密度，分别为0.179，0.330，0.520，0.700，0.870。以浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，作出标准曲线图，从图中求得斜率为l/3.71。
⑵ 样品测定
取1ml样品，稀释适当倍数，再加少许联二亚硫酸钠，在波长520nm处测定光密度。最后根据标准曲线的斜率计算其细胞色素C的含量。

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