简要分析基因的表达系统的组成及优化策略.

简要分析基因的表达系统的组成及优化策略.
简要分析基因的表达系统的组成及优化策略.

简要分析基因的表达系统的组成及优化策略.
原核表达系统 表达调控方式 组成型,诱导型 表达产物定位 分泌型,不分泌型(细胞内,细胞膜,周质空间) 产物纯化方式 是否融合蛋白,是否一步亲和纯化 产物溶解状况 可溶,包含体,分泌型
在各种表达系统中,最早被采用进行研究的是原核表达系统,这也是目前掌握最为成熟的表达系统.该项技术的主要方法是将已克隆入目的基因DNA片段的载体(一般为质粒)转化细菌(通常选用的是大肠杆菌),通过IPTG诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白.其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物,而且所需的成本相对比较低廉.但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点：如通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控,有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用,过量表达可能导致非生理反应,目的蛋白常以包涵体形式表达,导致产物纯化困难；而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善,表达产物的生物活性较低
为克服上述不足,许多学者将原核基因调控系统引入真核基因调控领域,其优点是
①根据原核生物蛋白与靶DNA间作用的高度特异性设计,而靶DNA与真核基因调控序列基本无同源性,故不存在基因的非特异性激活或抑制
②能诱导基因高效表达,可达105倍,为其他系统所不及；
③能严格调控基因表达,即不仅可控制基因表达的“开关”,还可人为地调控基因表达量
因此,利用真核表达系统来表达目的蛋白越来越受到重视.目前,基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统.
2RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术.首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA,再以cDNA为模板,扩增合成目的片段.RT-PCR技术灵敏而且用途广泛,可用于检测细胞中基因表达水平,细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列.作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物.无论使用何种RNA,关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染.
RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术.首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA,再以cDNA为模板,扩增合成目的片段.RT-PCR技术灵敏而且用途广泛,可用于检测细胞中基因表达水平,细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列.作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物.RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量.另外,这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cDNA文库克隆cDNA.RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术,更灵敏,更易于操作.逆转录反应可以使用逆转录酶,以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）起始.RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行.在两步法RT-PCR中,每一步都在最佳条件下进行.cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行,然后取出1/10的反应产物进行PCR.在一步法RT-PCR中,逆转录和PCR在同时为逆转录和PCR优化的条件下,在一只管中顺次进行.
逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶,至少具有以下三种活性：
1、 依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链
2、 Rnase水解活性：水解RNA杂合体中的RNA
3、 依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA
用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT 及基因特异性引物中的一种.对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA,三种都可.
实验方法如下
http://show.bioon.com/protocol/smallclass.asp?typeid=1724&newstype=RT-PCR
3 质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位,包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子.现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子.在基因工程中质粒常被用做基因的载体.许多细菌除了染色体外,还有大量很小的环状DNA分子,这就是质粒(plasmid)（补充：部分质粒为RNA）.质粒上常有抗生素的抗性基因,例如,四环素抗性基因或卡那霉素抗性基因等.有些质粒称为附加体(episome),这类质粒能够整合进细菌的染色体,也能从整合位置上切离下来成为游离于染色体外的DNA分子.
目前,已发现有质粒的细菌有几百种,已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA分子(简称cccDNA).细菌质粒的相对分子质量一般较小,约为细菌染色体的0.5%～3%.根据相对分子质量的大小,大致上可以把质粒分成大小两类：较大一类的相对分子质量是40×106以上,较小一类的相对分子质量是10×106以下(少数质粒的相对分子质量介于两者之间).每个细胞中的质粒数主要决定于质粒本身的复制特性.按照复制性质,可以把质粒分为两类：一类是严紧型质粒,当细胞染色体复制一次时,质粒也复制一次,每个细胞内只有1～2个质粒；另一类是松弛型质粒,当染色体复制停止后仍然能继续复制,每一个细胞内一般有20个左右质粒.一般分子量较大的质粒属严紧型.分子量较小的质粒属松弛型.质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关,某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型,而在变形杆菌内则属松弛型.
在基因工程中,常用人工构建的质粒作为载体.人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体,如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等.常用的人工质粒运载体有pBR322、pSC101.pBR322含有抗四环素基因(Tcr)和抗氨苄青霉素基因(Apr),并含有5种内切酶的单一切点.如果将DNA片段插入EcoRI切点,不会影响两个抗生素基因的表达.但是如果将DNA片段插入到Hind III、Bam H I 或 Sal I切点,就会使抗四环素基因失活.这时,含有DNA插入片段的pBR322将使宿主细菌抗氨苄青霉素,但对四环素敏感.没有DNA插入片段的pBR322会使宿主细菌既抗氨苄青霉素又抗四环素,而没有pBR322质粒的细菌将对氨苄青霉素和四环素都敏感.pSC101与pBR322相似,只是没有抗氨苄青霉素基因和PstI切点.质粒运载体的最大插入片段约为10 kb(kb表示为千碱基对).
4 基因诊断（gene diagnosis）是以探测基因的存在,分析基因的类型和缺陷及其表达功能是否正常,从而达到诊断疾病的一种方法.它是继形态学、生物化学和免疫学诊断之后的第四代诊断技术,它的诞生与发展得益于分子生物学理论和技术的迅速发展.
常用基因诊断技术：
一、Southern印迹法（Southern blot）
基本原理是：硝酸纤维膜或尼龙滤膜对单链DNA的吸附能力很强,当电泳后凝胶经过DNA变性处理,覆以上述滤膜,再于其上方压上多层干燥的吸水纸,借助它对深盐溶液的上吸作用,凝胶上的单链DNA将转移到滤膜上.转移是原位的,即DNA片段的位置保持不变.转移结束后,经过80℃烘烤的DNA,将原位地固定于膜上.
当含有特定基因片段已原位转移到膜上后,即可与同位素标记了的探针进行杂交,并将杂交的信号显示出来.杂交通常在塑料袋中进行,袋内放置上述杂交滤膜,加入含有变性后探针的杂交溶液后,在一定温度下让单链探针DNA与固定于膜上的单链基因DNA分子按碱基到互补原理充分结合.结合是特异的,例如只有β珠蛋白基因DNA才能结合上β珠蛋白的探针.杂交后,洗去膜上的未组合的探针,将Ⅹ线胶片覆于膜上,在暗盒中日光进行放射自显影.结合了同位素标记探针的DNA片段所在部位将显示黑色的杂交带,基因的缺失或突变则可能导致带的缺失或位置改变.
二、聚合酶链反应
近年来,基因分析和基因工程技术有了革命性的突破,这主要归功于聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）的发展和应用.应用PCR技术可以使特定的基因或DNA片段在短短的2－3小时内体外扩增数十万至百万倍.扩增的片段可以直接通过电泳观察,也可用于进一步的分析.这样,少量的单拷贝基因不需通过同位素提高其敏感性来观察,而通过扩增至百万倍后直接观察到,而且原先需要一、二周才能作出的诊断可以缩短至数小时.
三、扩增片段长度多态性
小卫星DNA和微卫星DNA的长度多态性可以通过PCR扩增后电泳来检出,并用于致病基因的连锁分析,这种诊断方法称为扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism,Amp-FLP）连锁分析法.PCR扩增后,产物即等位片段之间的差别有时只有几个核苷酸,故需用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离鉴定.此法多用于突变性质不明的连锁分析.
四、等位基因的特异寡核苷酸探针诊断法
当基因的突变部位和性质已完全明了时,可以合成等基因特异的寡核苷酸探针（allele-specific oligonucleotide,ASO）用同位素或非同位素标记进行诊断.探针通常为长20bp左右的核苷酸.用于探测点突变时一般需要合成两种探针,与正常基因序列完全一致,能与之稳定地杂交,但不能与突变基因序列杂交；另一种与突变基因序列一致,能与突变基因序列稳定杂交,但不能与正常基因序列稳定杂交,这样,就可以把只有一个碱基发生了突变的基因区别开来.
PCR可结合ASO,即PCR－ASO技术,即先将含有突变点的基因有关片段进行体外扩增,然后再与ASO探针作点杂交,这样大大简化了方法,节约了时间,而且只要极少量的基因组DNA就可进行.
五、单链构象多态性诊断法
单链构象多态性（signle strand conformation polymorphism,SSCP）是指单链DNA由于碱基序列的不同可引起构象差异,这种差异将造成相同或相近长度的单链DNA电泳迁移率不同,从而可用于DNA中单个碱基的替代、微小的缺失或手稿的检测.用SSCP法检查基因突变时,通常在疑有突变的DNA片段附近设计一对引物进行PCR扩增,然后将扩增物用甲酰胺等变性,并在聚丙烯酰胺凝胶中电泳,突变所引起的DNA构象差异将表现为电泳带位置的差异,从而可据之作出诊断.