微生物DNA提取的原理和方法是什么?

微生物DNA提取的原理和方法是什么?
微生物DNA提取的原理和方法是什么?

微生物DNA提取的原理和方法是什么?
细菌染色体DNA的抽提
一、 目的
熟练掌握抽提细菌DNA的一般方法
二、原理
要进行重组DNA 实验,就离不开外源基因的纯化,而外源基因主要来源之一就要直接从生物的染色体DNA上制备,所以制备高质量的染色体DNA样品经常为基因工程实验所需要,抽提细菌染色体DNA的方法目前已有许多种,这里所介绍的两种方法：一适用于枯杆菌染色体的抽提；另一种方法则适用于大肠杆菌染色体的制备.
基因工程实验所需要的基因组DNA 通常要求分子量尽可能大,以此增加外源基因获得率,但要获得大片段的DNA 非易事,细菌基因组DNA通常是个很大的环状态DNA,而在抽提过程中,不可避免的机械剪切力必将切断DNA,如果要抽提到大的DNA 分子,就要尽可能地温和操作,减少剪切力,减少切断DNA 分子的可能性；分子热运动也会减少所抽提到的DNA分子量,所以提取过程也要尽可能在低温下进行.另外细胞内及抽提器皿中污染的核酸酶也会降解制备过程中的DNA,所以制备过程要抑制其核酸酶的活性.
另外制备的细菌染色体DNA 必须是高纯度的,以满足基因工程中各种酶反应的需要,制备的样品必须没有蛋白污染,没有RNA,各种离子浓度应符合要求,这些在染色体制备时都应考虑到.
大肠杆菌染色体DNA 抽提首先收集对数生长期的细胞,然后用离子型表面活性剂十二烷基磺酸钠（SDS）破裂细胞,SDS 具有的主要功能是：（1）溶解细胞膜上的脂类和蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜；（2）解聚细胞膜上的脂类和蛋白质,有助于消除染色体DNA上的蛋白质；（3）SDS 能与蛋白质结合成为R1—0—SO3R2—蛋白质的复合物,使蛋白质变性而沉淀下来.但是SDS 能抑制核糖核酸酶的作用,所以在以后的提取过程中,必须把它除干净.以免影响下一步RNase的作用.破细胞后RNA经RNase消化除去,蛋白质经苯酚、氯仿:异戊醇抽提除去经洒精沉淀回收DNA.枯草杆菌染色体制备与上类似,但略加修改的方法要适合教学要求.枯草杆菌是格兰氏阳性菌,所以在SDS 处理前需要使用溶菌酶裂解细胞壁.溶菌酶是一种糖苷水解酶,它能水解菌体细胞壁的主要化学成份肽聚糖中的β—1,4 糖苷键,有助于细胞壁破裂,破裂的细胞壁在SDS 的作用下溶菌,同时用蛋白酶K 消化蛋白质,能解离缠绕在染色体DNA上的蛋白质,然后加入一定量的醋酸钾,使蛋白质变性,通常离心除去,在这期间可加入核糖酸酶消化RNA,最后用乙醇回收DNA.
此二种方法抽提的细菌染色体DNA,无RNA和蛋白质污染,可用于限制性内切酶消化,分子再克隆等.但在下一步实验前,要测定其DNA的浓度,常用测定DNA 浓度的方法,是溴化乙锭电泳法；当DNA 样品在琼脂糖凝胶中电泳时,加入的EB 会增强发射的荧光.而荧光的强度正比于DNA 的含量,如将已知浓度的标准样品作电泳对照,就可估计出待样品的浓度.
三、材料
（一）菌株
大肠杆菌C600、枯草杆菌BR151.
（二）仪器
电泳设备、恒温水浴锅、低速离心机、恒温振荡器、紫外检测仪.
（三）器皿
玻璃离心管（10 毫升）、移液管（10毫升、5毫升）、微量取样器、烧杯、玻璃棒、试管、三角瓶
（四）试剂
（1）LB 完全肉汤培养液：1%蛋白胨 0.5%酵母粉 0.5%NaCl pH7.5.
（2）BY 培养液：1%蛋白胨 0.5%牛肉膏 0.5%酵母粉 0.5%葡萄糖 0.5%NaClpH7.5
（3）SET 溶液：20%蔗糖；50mmol/L Tris—HCl（pH7.6） 50mmol/L EDTA.
（4）20%SDS
（5）饱和酚
（6）氯仿:异戊醇（24:1 V:V）
（7）预冷无水酒精
（8）TE 溶液
（9）RNase溶液
（10）5mol/L 醋酸钾
（11）蛋白酶K 20mg/ml
四、实验步骤
1、取大肠杆菌C600单菌落于5 毫升LB培养液中,37℃振荡培养过液.
2、将上述菌液1%接种量接种于20 毫升LB 培养液中,37℃摇床振荡培养过夜.
3、已培养好的菌液,收集于10毫升的离心管中,在低速离心机上4000r/min离心10分钟,去上清,留沉淀菌体.
4、用5 毫升的SET 溶液悬浮细胞,加入20% SDS 1毫升,37℃下轻摇过夜,使细胞裂解.
5、加入等体积的饱和酚,上下轻轻摇匀,放置5 分钟后,在低速离心机上3500r/min离心10 分钟.
6、取上相,加入1/2 体积的饱和酚,1/2体积的氯仿异:戊醇,上下翻转均匀,3500r/min离心10 分钟.
7、取上相,加入等体积的氯仿:异戊醇,如第6步,离心.
8、取上相于一干净离心管中,另在一个50 毫升的烧杯中加入15毫升预冷无水酒精,把上述的上相液沿着玻棒慢慢倒入酒精中,并温和地搅拌以使DNA 附着于玻棒上.
9、挑起DNA,再放于干净的酒精中洗涤,然后把DNA溶于50 毫升TE 中,待测浓度.
（二）枯草杆菌染色体DNA 的抽提
1、在BY 斜面上划线活化枯草杆菌BR151.
2、挑一环已活化的BR151 菌株于20 毫升的BY培养液中,37℃摇床振荡培养过液.
3、过夜培养物,收集10 毫升于离心管内,在低速离心机上3500r/min离心10 分钟.
4、沉淀菌体加入0.75 毫升溶菌酶液（8 毫克溶菌酶/1毫升SET）,振荡器上悬浮细胞,悬浮液移入1.5 毫升离心管,室温30 分钟.
5、在反应液中加入0.15毫升SDS溶液,蛋白酶K 溶液5 微升,37℃水浴10 分钟后转入75℃水浴5 分钟.
6、加入5mol/L 醋酸钾0.3 毫升,上下翻转均匀,置于冰上30 分钟,期间不时摇动.
于台式高速离心机离10000r/min10 分钟.
7、上清液移入另一离心管,弃沉淀.重复第六步.
8、上清液移入5 毫升的离心管内,缓慢加入2倍体积的无水酒精,DNA呈絮状沉淀.用一灭菌牙签,挑起DNA 沉淀,溶于50微升TE中.待检查浓度.
9、若无絮状沉,则把其置-20℃冷冻3 小时（或-70℃冷冻30 分钟）,取出离心10 分钟（10000rPm）,去上清,晾干,加入50ul TE溶解（取20ul 点样测定）.
（三）染色体DNA 制备样品浓度测定
1、按实验一方法制备琼脂糖凝胶（0.6%）
2、分别取标准浓度的λDNA 0.05ug、0.1ug、0.15ug、0.2ug,加相应的加样缓冲液混合好,点样.
3、取2 微升染色体DNA 样品点样(冷冻离心获取的DNA样品取50 微升点样),打开电泳仪电泳,待溴酚兰进入凝胶2 厘米后,停止电泳,紫外灯下观察,估计样品DNA浓度.
五、结果讨论与问题
紫外光下观察DNA 样品纯度,计算出制备的DNA总量和浓度.
1、SDS 在抽提DNA 过程有哪几个作用?
2、在本实验中未加入RNase,那么样品中应出现什么情况?