DNA和RNA提取原理是什么?还有相关试剂盒的原理,各步的作用~

DNA和RNA提取原理是什么?还有相关试剂盒的原理,各步的作用~
DNA和RNA提取原理是什么?还有相关试剂盒的原理,各步的作用~

DNA和RNA提取原理是什么?还有相关试剂盒的原理,各步的作用~
TRIzol试剂有多组分分离作用,与其他方法如硫氰酸胍/酚法、酚／SDS法、盐酸胍法、硫氰酸胍法等相比,最大特点是可同时分离一个样品的RNA\DNA\蛋白质．TRIzol使样品匀浆化,细胞裂解,溶解细胞内含物,同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性.在加入氯仿离心后,溶液分为水相和有机相,RNA在水相中.取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质.
TRIzol试剂可用于小量样品（50-100mg组织、5×106细胞）也适用于大量样品（≥1g组织、>107细胞）.对人,动物,植物组织,细菌均适用,可同时处理大量不同样品,整个提取过程在一小时内即可完成.分离的总RNA无蛋白质和DNA污染,可用于Northern Blot,dot blot,ployA筛选,体外翻译,RNase保护分析和分子克隆.在用于RT-PCR时如果两条引物存在于一个单一外显子内,建议用无RNase的DNaseⅠ处理RNA样品,避免出现假阳性.共纯化的DNA可用作标准,比较不同样品RNA的得率,也可用于PCR和酶切.蛋白质可用于Western Blotting.
预防RNase污染注意事项：
1． 经常更换新手套,皮肤上常带有的细菌,霉菌可能成为RNase的来源.
2． 使用灭过菌的RNA专用塑料制品避免交*污染.
3． RNA在TRIzol试剂中时不会被RNase污染,但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿.玻璃器皿可在150℃烘烤4小时,塑料制品可在0.5M NaOH中浸泡10分钟,然后用水彻底清洗,高压灭菌,即可去除RNase.
4． 配制溶液应使用无RNase的水（将水加入处理过不含RNase的玻璃瓶中,加入DEPC至终浓度0.01℅v/v,放置过夜,高压灭菌.注：DEPC有致癌之嫌,需小心操作.）
RNA的提取
准备试剂：氯仿,异丙醇,75℅乙醇,无RNase的水或0.5℅SDS(溶液均需用DEPC处理过的水配制)
操作步骤:
1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理.样品体积不应超过TRIzol体积10℅.
b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞,每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml,用移液器吸打几次.TRIzol的用量应根据培养板面积而定,不取决于细胞数.TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染.
c．细胞悬液 离心收集细胞,每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol,反复吸打.加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解.一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理.
2．将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟,使核酸蛋白复合物完全分离.
3．可选步骤：如样品中含有较多蛋白质,脂肪,多糖或胞外物质（肌肉,植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟,取上清.离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA.处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除.取澄清的匀浆液进行下一步操作.
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿,剧烈振荡15秒,室温放置3分钟.
6. 2-8℃10000×g离心15分钟.样品分为三层：底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层.RNA主要在水相中,水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅.
7. 把水相转移到新管中,如要分离DNA和蛋白质可保留有机相,进一步操作见后.用异丙醇沉淀水相中的RNA.每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇,室温放置10分钟.
8. 2-8℃10000×g离心10分钟,离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀.移去上清.
9. 用75℅乙醇洗涤RNA沉淀.每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇.2-8℃不超过7500×g离心5分钟,弃上清.
10.室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀,大约晾5-10分钟即可.不要真空离心干燥,过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低.加入25-200μl无RNase的水或0.5℅SDS,用枪头吸打几次,55-60℃放置10分钟使RNA溶解.如RNA用于酶切反应,勿使用SDS溶液.RNA也可用100℅的去离子甲酰胺溶解,-70℃保存.
注意事项：
1.从少量样品（1-10mg组织或102-104细胞）中提取RNA时可加入少许糖原以促进RNA沉淀.例如加800ml TRIzol匀浆样品,沉淀RNA前加5-10μg RNase-free糖原.糖原会与RNA一同沉淀出来,糖原浓度不高于4mg/ml是不影响第一链的合成,也不影响PCR反应.
2．匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至-70℃保存至少一个月.RNA沉淀可以保存于75% 酒精中2-8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上.
3．分层和RNA沉淀时也可使用台式离心机,2600×g离心30-60分钟.
预期产量：1mg组织或1×106细胞提取RNA分别为：
肝和脾6-10μg ,肾3-4μg ,骨骼肌和脑组织1-1.5μg ,胎盘1-4μg ,上皮细胞8-15μg ,成纤维细胞5-7μg .
常见问题分析：
得率低：A.样品裂解或匀浆处理不彻底
B．RNA沉淀未完全溶解
A260/A28012000×g离心10分钟除去.
DNA的定量：取一份溶于8mM NaOH的DNA加水测A260值.一单位A260值相当于50μg/ml双链DNA.根据DNA产量可估计细胞数,人,大鼠,小鼠1×106二倍体细胞含DNA的量分别为7.1μg , 6.5μg , 5.8μg .
预期产量：1mg组织或1×106细胞提取DNA分别为肝和肾3-4μg 骨骼肌,脑组织,胎盘2-3μg 人,大鼠,小鼠培养细胞（1×106）5-7μg 成纤维细胞5-7μg
应用：1.用于PCR 溶于8mM NaOH的DNA用0.1M HEPES调pH至8.4,取0.1-1μg DNA用作模板.
2.酶切反应 用HEPES或1mM EDTA调节pH至适当值.每μg DNA使用3-5单位的酶,80-90%的DNA是可消化的.
1ml 8mM NaOH溶解的DNA样品pH值调节
Final pH 0.1M HEPES(μl) Final pH 1M HEPES(μl)
8.4 86 7.2 23
8.2 93 7.0 32
8.0 101
7.8 117
7.5 159
注意事项：
1. DNA在中间层和有机相中时可在2-8℃保存过夜.
2．DNA沉淀在75%乙醇中2-8℃可保存几个月.
3．DNA在8mM NaOH溶液中4℃可放置过夜,如长期保存需用HEPES调节pH至7-8并且加EDTA至1mM,可置于4℃或-20℃长期保存.