茚三酮显色问题本人做叶片中游离氨基酸的含量的测定,用的茚三酮法.但是将处理好的混合试剂用分光光度计比色的时候,发现数值会不断地下降,而且很厉害.这是什么原因?将试液放入试管水

茚三酮显色问题本人做叶片中游离氨基酸的含量的测定,用的茚三酮法.但是将处理好的混合试剂用分光光度计比色的时候,发现数值会不断地下降,而且很厉害.这是什么原因?将试液放入试管水
茚三酮显色问题
本人做叶片中游离氨基酸的含量的测定,用的茚三酮法.但是将处理好的混合试剂用分光光度计比色的时候,发现数值会不断地下降,而且很厉害.这是什么原因?将试液放入试管水浴,混合试液颜色会由浅黄慢慢变成深红紫色,取出后过一段时间待试液冷却后,颜色就会慢慢变浅,这是什么原因?哪位高人能解答?
所用试剂：
水合茚三酮试剂： 取 0．6g茚三酮置于烧杯中，加 l5ml 正丙醇，令其溶解，再加30 ml 正丁醇，6 0m1 乙二醇，最后加入 9ml pH5．4 0．2M的醋酸盐缓冲液。
PH值为5.5左右的醋酸-醋酸钠缓冲液。
0.3%抗坏血酸
简单说下过程，我测的是竹叶中的游离氨基酸，取材料0.1g，加3ml 0.2M的醋酸迅速研磨，研磨后用滤纸过滤，用缓冲液定容到50毫升。开水水浴10分钟，，目的是沉淀样品中的蛋白质和氧化抗坏血酸．然后冷却 。然后在另外的试管中加入3ml茚三酮，1ml缓冲液，1ml样液，0.1ml抗坏血酸，再水浴10分钟，冷却，稀释。580nm测吸光度！吸光度读数基本是1-2秒就减少1，10分钟内能从300多掉到100多。该取哪个读数？真不清楚中间是怎么个原因。是不是氨基酸浓度太低？因为感觉我做的空白对比读数下降的更快。另外我的样液水浴后是呈红葡萄酒那样的深红紫色，这是不是就是书上所谓的蓝紫色？

茚三酮显色问题本人做叶片中游离氨基酸的含量的测定,用的茚三酮法.但是将处理好的混合试剂用分光光度计比色的时候,发现数值会不断地下降,而且很厉害.这是什么原因?将试液放入试管水
我觉得楼上的解答有个不妥之处：楼主说明了过程,无论是反应前试样的处理还是反应后的测定,都是冷却了的.所以,温度这方面应该不会影响测定了.而楼主担心的氨基酸浓度过低这种假设可能也不会很大,因为茚三酮的显色反应检出下限很低,只要有几微克的氨基酸都能检测出来.
所以我分析可能有两个原因：
1,pH值的影响.楼主在实验中两次用到缓冲液调节pH=5.5,但是在最后显色的一步是在加热的状况下进行的.没有在反应过程中检测pH值的变化,导致颜色不是Ruhemann紫.而茚三酮与氨基酸作用得到的蓝紫色物质是一种铵盐.从结构上看,季铵和还原的酮的氧连在一起,这本来就是个亚稳定结构.季铵盐容易把H+给O得到一个羟基,所以很依赖pH的变化.那么你的溶液不停变化吸光度就能解释了,是由于Ruhemann紫因pH不适不断释放NH3或NH4+的结果.这个情况一般是由于pH值过大引起的.
2,没有反应完全.在进行样品沉降时其实很有可能残留了许多蛋白质和多肽.多肽和蛋白质也能形成这个反应,但是肽越大反应就越不灵敏.所以有可能是第三产物,中间得到的醛可能会影响了这个反应,可能会生成其他带有颜色的副产物干扰紫色的呈现.但是在逐渐反应后,醛由于大基团逐渐分解对反应的影响越来越小,这个干扰也就变小了,实际的紫色浓度自然比原来要弱许多.
以上只是个人推测,没有依据.建议你用其它方法测定,比如用茚三酮作显色剂的纸层析色谱,不仅可以计算总量,还可以初步估计氨基酸种数.

我不知道我能不能帮到你。
分光光度计所测光度值并不会是一成不变的，我做分析化学实验时发现，当温度改变时，所测数据也会改变。光照待测液体久了，温度上升，光度值反而减小。
茚三酮显色后进行水浴，此时已经吸收了一定的光，也有了一定的温度（液体有一定的热量）。在一定温度下，（氨基酸与茚三酮水合物在弱酸条件下共加热时）氨基酸被氧化脱氨、脱羧，而茚三酮水合物被还原，其还原物可与氨基酸加热分解产...

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我不知道我能不能帮到你。
分光光度计所测光度值并不会是一成不变的，我做分析化学实验时发现，当温度改变时，所测数据也会改变。光照待测液体久了，温度上升，光度值反而减小。
茚三酮显色后进行水浴，此时已经吸收了一定的光，也有了一定的温度（液体有一定的热量）。在一定温度下，（氨基酸与茚三酮水合物在弱酸条件下共加热时）氨基酸被氧化脱氨、脱羧，而茚三酮水合物被还原，其还原物可与氨基酸加热分解产生的氨结合，再与另一分子茚三酮缩合成为蓝紫色化合物，称为罗曼紫------------你看到的可能是这个颜色。
取出后过一段时间待试液冷却后，温度慢慢回到开始，颜色也会慢慢变浅。
但是我有一点不明白，茚三酮显色基本都要加热来显紫色，因为茚三酮跟酶类或者多肽在加热状况下发生显紫色反应，应该在测光度时就应该呈现紫色，除非你没有加热，纠结，解答一下，我才大一啊，想不通~~~~~~~~~

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可惜我大学课本没带来