抗生素微生物检定方法在药典哪部里

抗生素微生物检定方法在药典哪部里
抗生素微生物检定方法在药典哪部里

抗生素微生物检定方法在药典哪部里
抗生素微生物检定管碟法在中国药典中的应用及操作要点
录入时间:2010-11-18 10:29:10 来源：青岛海博

抗生素微生物检定法可分为：（1）稀释法；（2）比浊法；（3）琼脂扩散法（管碟法和打孔法）.各国药典通常采用后两种方法测定抗生素的效价.
管碟法：利用抗生素在摊布特定试验菌的固体培养基内成球面形扩散,形成含一定浓度抗生素球形区,抑制了试验菌的繁殖而呈现出透明的抑菌圈.
此法系根据抗生素在一定浓度范围内,对数剂量与抑菌圈直径（面积）呈直线关系而设计,通过检测抗生素对微生物的抑制作用,比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小,计算出供试品的效价.
原理：利用抗生素在固体培养基中的平面扩散作用,依据量反应平行线原理并采用交叉实验设计方法,在相同实验条件下通过比较标准品（已知效价）和供试品两者对所接种试验菌产生的抑菌圈（直径或面积）大小,来测定供试品效价的一种方法.
管碟法的操作步骤：
1、预试验：确定最佳的试验条件：调整试验菌的浓度、使用量、抗生素终浓度、培养基等,使抑菌圈的大小符合规定：一剂量法中心点的抑菌圈直径应在16～17.5mm,二剂量法高剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在18～22mm,三剂量法中间剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在15～18mm.
2、试验准备：双碟、钢管、毛细滴管、吸管的清洗及灭菌；容量瓶、定量吸管的清洗；培养基、缓冲液的准备、半无菌间的紫外消毒等.
3、双碟的制备：每只双碟加底层培养基约20ml,待培养基凝固后,将双碟放入35～37℃培养箱中,待用.
4、供试品、标准品溶液的制备：估计供试品的效价,根据试验要求设计供试品、标准品溶液稀释步骤,平行制备供试品、标准品相关剂量的溶液.
5、菌层的制备：注意菌层培养基温度；根据预试验确定加入菌层培养基的菌液量,注意制备菌层的速度和平整度.
6、滴加抗生素溶液：注意标准品、供试品高、低剂量溶液滴加顺序,保证滴加速度和加量的均匀一致. 7、双碟的培养：根据培养温度的要求在培养箱中进行培养,培养箱中水平碟放的双碟数以不超过三层


为宜.
8、抑菌圈的测量：抑菌圈测量仪的使用,每组试验双碟应在相同的测量参数下进行测量.手工测量：游标卡尺
9、结果的可靠性检验及效价测定：抑菌圈测量仪提供计算结果或手工计算结果. 操作要点
第一步一般应制成500或1000单位/毫升的溶液,以后逐步稀释至供试浓度的溶液,稀释步骤应为3～4步.
溶对于需用乙醇溶解的样品,由于溶解样品时所用乙醇量较大,加灭菌水后溶液放热,因此需充分摇匀后加灭菌水至接近容量瓶刻度,待冷至室温后再稀释至刻度.
标准品溶液与供试品溶液浓度的比值D应控制在±5%以内,以保证两者浓度的偏差在一定范围内. 试验菌的菌龄对抑菌圈有一定影响.故检定时应保持菌种及菌液的新鲜.
一般菌种一月转种一次,冰箱冷藏保存.对易变异的菌株,如藤黄微球菌等在制备菌悬液前进行单菌分离；其他菌株可半年分离一次.
试验菌传代最好不超过5次,以防止菌种老化变异.芽孢杆菌培养物用灭菌水洗下后,应在65℃加热30分钟,使菌体的菌龄一致,用革兰氏染色,应有芽孢85%以上.
加入菌悬液的体积,一般不少于0.3ml,并且不大于上层培养基体积的2%.如果加入菌悬液的体积过小,则在同次实验中,不同次加入菌悬液的体积相差较大,造成实验误差；如果加入菌悬液的体积过大,则会使上层培养基变稀,并且因菌悬液的温度较低,加至培养基中可能造成培养基结块,影响测定结果.对于加入菌悬液体积的控制,可通过调节菌悬液的浓度来实现.
在制备菌层培养基时,将菌液加入菌层培养基后,立即充分摇匀,但应避免产生气泡.
加入芽孢悬液时,菌层培养基的温度为65℃,对非芽孢悬液时,菌层培养基的温度一般为48～50℃. 放置孵箱培养时排放应不得超过三层,避免因培养温度不均匀而导致各双碟中抑菌圈大小不一.
抗生素原料药：不含辅料的药物制剂原料,一般其效价以纯度（u/mg或?g/mg）表示.检验时,可参考该品种的药品标准纯度限度规定或厂方提供的纯度估计效价,取样试验,如估计效价与实际效价相差较远时,即测定所得效价超出估计效价的±10%时,则重新估计效价,再做准确测定.

粉针剂：指注射用无菌粉末或冻干品,用西林瓶橡胶塞铝盖封装或熔封在安瓶内,一般测定其纯度（u/mg或?g/mg）或整瓶效价.
取装量差异项下的内容物,称取适量（50mg以上,根据标示量及平均装量折算估计效价,并按估计效价及量瓶体积计算取样量）,置量瓶中,加标准中规定的溶剂溶解,稀释,测定,计算出1mg的效价单位数,再根据平均装量及标示量计算平均每瓶的百分含量.
水针剂（注射液）：即抗生素的灭菌水溶液,标示量一般按每毫升含效价单位计.
效价测定时,量取平均装量项下的内容物或5～10支的内容物,混匀,用干燥的刻度吸管吸取一定量的供试品,将吸管外壁用滤纸拭净,再弃去多余的溶液,使供试品至吸管刻度,沿量瓶颈部内壁缓缓流入已盛有一定量溶剂（以免抗生素结晶析出）的量瓶内,混匀,继续加溶剂至刻度,摇匀,再量取适量稀释至规定的浓度.
素片、薄膜衣片：称取20片的总量,求出平均片重,研细混匀后,精密称取适量（约相当于1片的重量或根据标示量按平均片重及所用量瓶体积折算取样量）,置量瓶中,用标准中规定的溶剂溶解,并稀释至刻度,摇匀.再量取适量稀释至规定浓度.
注意点：研磨时应注意环境干燥,可在干燥操作柜内操作,研磨要迅速,避免吸湿,因片剂内含辅料较多,辅料可能漂浮于溶液表面,稀释时量取供试溶液应读取辅料下层的溶液切面；如沉淀较多,须待其下沉后再量取上层液；有些辅料吸附抗生素,应加以注意.为节约供试品,可与重量差异检查结合进行. 糖衣片、肠溶片：取标准中规定的片数,置于乳钵中,研细,分次加入规定的溶剂,研磨使其溶解,将研磨液转移至瓶口放有小漏斗的量瓶中,量瓶体积根据供试品标示量、所取片数及抗生素储备液浓度（一般为1000单位/ml）选定,用规定溶剂稀释至刻度,摇匀,静置,使辅料下沉而抗生素已溶解在溶液内,精密吸取量瓶中的上层液适量,作进一步稀释.个别品种标准如同时收载了糖衣片和薄膜衣片,可能规定薄膜衣片也取整片制备供试溶液.
胶囊剂：取装量差异项下的内容物,混合均匀,研细,根据平均装量,精密称取约相当于1粒胶囊的量或按标示量、量瓶体积及抗生素储备液浓度等计算的取样量,置于量瓶中,加规定的溶剂溶解并稀释至刻度,摇匀,如供试品含有较多的辅料,则照片剂项下的方法进行.
颗粒剂、干混悬剂：取装量差异项下的内容物,混匀,根据平均装量,精密称取约相当于1袋（包）的量或按标示量、量瓶体积及抗生素储备液浓度等计算的取样量,置于量瓶中,加规定的溶剂溶解并稀释至刻度,摇匀.量取适量稀释制成供试品溶液.测得效价后,再根据装量差异项下的平均装量,计算出平

均每袋（包）的效价,根据标示量即可算出含量.
软膏剂、眼膏剂：擦净软膏剂或眼膏剂软管的外壁,切开封口,置于干燥器内约1小时,取干燥的洁净分液漏斗,带手套操作,将膏剂软管连同内容物在天平上称重,取出,将内容物挤入分液漏斗,量约2g,再称取膏剂软管的重量,按减重法以前后称量之差计算分液漏斗内膏剂供试品的量,以不含过氧化物的乙醚或石油醚等作溶剂溶解基质,但基质中的抗生素则应不溶于或几乎不溶于该有机溶剂中,以避免提取过程中抗生素的损失.按标准中的规定加提取溶剂至分液漏斗中,振摇,使基质溶解,用规定的缓冲溶液提取抗生素至水相中,用缓冲溶液提取3次,合并3次的提取液,置量瓶中,加缓冲溶液至刻度,依法操作,计算效价. 实验要点
磷霉素钠,磷霉素钙,磷霉素氨丁三醇 主要问题：抑菌圈偏小 解决：
1. pH9.0抗Ⅱ号培养基（pH7.8～8.0）
2. 滴加药液后,室温放置1小时后,放入孵箱内培养.
3. 培养时间以24小时为宜,培养时间短,抑菌圈清晰度不好,培养24h后如抑菌圈仍不清晰,应室温放置一段时间待清晰后再测量.
啤酒酵母菌的培养 主要问题：生长不良
CP2005：抗Ⅴ号琼脂斜面及抗Ⅳ琼脂斜面
解决：1. 采用沙氏或YPD酵母菌培养基；2. 32～35℃培养24小时
沙氏培养基 蛋白胨10g 葡萄糖40g 琼脂13g 水1000ml 调节灭菌后pH5.4～5.8


YPD培养基 蛋白胨10g 葡萄糖40g 酵母粉5g 琼脂13g 水1000ml
管碟法特点：
优点：基本操作和设计适用于各种抗生素,试验结果较稳定；样品用量少,灵敏度高；适合于大批样品的测定.
缺点:凡具有抗菌活性的物质都会干扰测定结果；试验过程长,需第二天才有结果；操作手工化,需熟练人员才能得到较正确的结果；受扩散因素的影响,如培养基原材料的质量,一般琼脂中的杂质可能影响扩散速度及效价强度
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