免疫组化具体过程及细胞爬片
来源：学生作业帮助网 编辑：六六作业网 时间：2024/12/29 20:19:52
免疫组化具体过程及细胞爬片
免疫组化具体过程及细胞爬片
免疫组化具体过程及细胞爬片
细胞爬片的免疫组化过程大概如下：
1.细胞爬片,5天后进行免疫细胞组织化学染色定.
2.PBS清洗标本 3次 各 1 min.
3 .冰丙酮固定 15 min(或4%多聚甲醛固定30min).
4.空气干燥 5min.
5.PBS清洗标本 3次 各 2 min.
6.0.5%Triton X-100( DPBS配 ) 孵育 1次 20min.
7.PBS清洗标本 3次 各 2 min.
8 .3%H2O2（试剂A）孵育 15 min.
9.DPBS清洗标本 3次 各 2 min.
10.封闭血清孵育（试剂B） 20min.
11 .一抗孵育（滴度1：200,湿盒）4℃ 过夜或37℃60 min.阴性对照最好用一抗来源血清,否则用PBS液
12.PBS清洗标本 3次 各 5 min.
13 .二抗工作液孵育（湿盒试剂C） 37℃30 min.
14 .PBS清洗标本 3次 各 5 min.
15.试剂D（湿盒） 37℃ 30 min.
16、PBS清洗标本 3次 各 5 min.
17、DAB显色（避光,镜下观察至棕色 ） 约3~10min.
18、蒸馏水洗 2次 1 min.
19、苏木素复染 0.1min.
20、自来水洗返蓝.
21.梯度酒精脱水75,85,95,100%各3min.
22.二甲苯透明2次3min.
23、中性树胶封片.
注意事项：
1、良好的细胞爬片是进行免疫组织细胞的基础,要获得良好细胞爬片须注意以下：
a对于粘附分子较少的细胞爬片时间要达5天以上这样细胞爬片才较牢固冲洗时不易脱片；
b接种的细胞密度适中以2*104/ml为宜,若密度太高5天后细胞连接成片冲洗时易脱片；
2、冰丙酮固定后玻片可密闭保存于4C冰箱,冰丙酮固定时会使细胞收缩,可用80%冰丙酮或2%多聚甲醛固定.
3、冲洗时只须轻轻振荡培养皿,（不可用吸管太用力吹,易脱片）
4、加一抗、二抗后冲洗时第一次须将玻片倾斜
5、Triton X-100表面活性剂,脱去细胞膜中最主要的成分脂质,对于抗原表达在胞浆或胞核者方使用,对于抗原表达在胞浆者时间要控制好,使其破坏细胞膜而核膜破坏较少.